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文檔簡介
1、目的:
為開發(fā)新的祛痰及抗氣道炎癥有效藥物,通過急性毒性實驗觀察白花丹地上部分莖葉水提物(APPZ)的毒性反應(yīng);氣管酚紅排泄實驗,考察APPZ是否具有祛痰作用;建立小鼠急性肺損傷模型,觀察APPZ對于急性氣道炎癥的干預(yù)作用,并進(jìn)一步觀察霧化吸入給藥方式對于小鼠急性氣道炎癥的治療效果。
方法:
1、APPZ的急性毒性實驗:(1)APPZ的制備:白花丹地上部分新鮮莖葉置60°C干燥箱48h后,剪碎、稱重后放入燒
2、杯,加20倍量的純凈水,煮沸后文火煎煮1 h,冷卻、收集過濾液;濾渣再加入20倍量純凈水,重復(fù)煎煮2次;3次濾液混合后,文火濃縮濃度至0.1 g/ml;冷卻至室溫后分裝,-20°C保存?zhèn)溆谩#?)20只SPF級KM小鼠,雌雄各半,體重18g-22g,隨機(jī)分為2組,實驗第1天,對照組給予生理鹽水30ml/kg,實驗組灌胃給予小鼠,上、下午各一次,每次0.6 ml。給藥后連續(xù)觀察14天,記錄小鼠活動情況及死亡數(shù)量。
2、酚紅排泄實
3、驗:60只SPF級雄性C57LB/6小鼠,體重18g-22g,隨機(jī)分為6組;正常對照組每天灌胃30ml/kg生理鹽水(NS),氯化銨組每天灌胃氯化銨1g/kg,藥物組分高、中、低、極低劑量組分別灌胃給予小鼠APPZ,約合白花丹干重質(zhì)量3.0 g/kg、1.5 g/kg、0.75 g/kg、0.375 g/kg。連續(xù)給藥5天后,每只小鼠腹腔注射1.5%酚紅溶液,0.2 ml/10g;半小時后收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF),通過分光光
4、度計在波長546 nm處比色,計算酚紅排泄量。
3、(1)通過經(jīng)口-氣管噴霧給藥脂多糖(LPS)的方法,建立小鼠急性肺損傷模型,觀察造模后第3天和第5天小鼠BALF中總蛋白濃度。(2)APPZ對小鼠急性氣道炎癥的干預(yù)作用:90只SPF級雄性BALB/c小鼠,體重20g-22g,隨機(jī)均分為6組,除正常組經(jīng)口-氣管噴霧150ul/只NS,其余組給藥LPS建立急性肺損傷模型。待動物清醒后,正常對照組和模型組灌胃給予NS(30ml/k
5、g),模型+藥物高劑量、模型+中劑量、模型+低劑量組灌胃給予APPZ分別相當(dāng)于3.0 g/kg、1.5g/kg、0.75g/kg;模型+地塞米松組小鼠灌胃給予地塞米松(DXM)1 mg/kg。連續(xù)給藥5天后,BCA法檢測實驗小鼠BALF中總蛋白濃度,ELISA法檢測炎癥因子包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的含量;比較肺臟濕/干重比值(W/D);肺組織HE染色觀察比較各組間小鼠肺部病理變化。
4、APP
6、Z霧化吸入治療小鼠急性氣道炎癥的效果:100只SPF級雄性BALB/c小鼠,體重20g-22g,隨機(jī)分均為5組。建立急性肺損傷模型后(同研究方法3),正常對照組和模型組每天8ml生理鹽水霧化;模型+白花丹高劑量組每天給予16 ml(0.1g/ml)的藥物霧化吸入(分上、下午兩次進(jìn)行);模型+白花丹低劑量組每天給予一次8 ml(0.1g/ml)霧化吸入治療;模型+地塞米松組每天給予地塞米松1 mg/kg灌胃;每組動物分別于給藥第3天和第5
7、天各處死一半,檢測內(nèi)容同研究方法3。
結(jié)果:
1、KM小鼠灌胃給藥6 g/kg,持續(xù)觀察14天,小鼠沒有出現(xiàn)死亡及其他急性毒性反應(yīng),說明該APPZ水提物毒性較低。
2、小鼠支氣管肺泡灌洗液酚紅濃度比較顯示,與空白對照組(8.25±0.64ug/ml)比較, APPZ高劑量組(13.20?3.07ug/ml),中劑量組(12.74?1.44ug/ml)和低劑量組(10.67?2.28ug/ml)的小鼠氣管酚紅
8、排泄量顯著增加(P<0.05)。氯化銨組,APPZ高、中、低劑量組的小鼠氣管酚紅排泄量改善率分別為62.9%,60%,54.4%,29.3%。
3、(1)小鼠經(jīng)口-氣管噴霧給予LPS的方式可成功建立小鼠急性肺損傷模型,通過比較確定,LPS劑量在2mg/ml,150ul/只時,作為本實驗?zāi)P蛷?fù)制的劑量;(2)APPZ灌胃對小鼠急性氣道炎癥的干預(yù)作用:各組收集到的BALF中總蛋白濃度,同模型組(427.68±80.84ug/ml)
9、對比, APPZ高劑量組(329.35±14.23ug/ml),正常組(270.17±62.37ug/ml)和地塞米松組(263.69±77.44ug/ml)同模型組比較,差異具有顯著性(P<0.05);各組小鼠BALF中TNF-a,IL-6含量同模型組相比有所減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;肺的濕干比值,正常對照組(4.68±0.26),地塞米松組(4.33±0.05)和APPZ高劑量組(4.87±0.07)同模型組(5.41±0.67)比
10、較有顯著性差異(P<0.05);顯微鏡下觀察模型組小鼠肺泡腔及其周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增厚,肺組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞,其余各組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對完整,肺泡腔清晰可見,周圍僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤。
4、APPZ霧化吸入治療急性氣道炎癥的效果顯示:(1)APPZ霧化給藥3天后,與模型組BALF中總蛋白濃度(793.95±186.19μg/ml)相比,地塞米松組(556.36±139.69μg/ml)、低劑量霧化組(628.5
11、9±140.47μg/ml)及正常組(308.65±45.82μg/ml)與模型組相比,差異具有顯著性(P<0.05);與模型組比較,TNF-a、IL-6的濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。同樣,肺組織濕干比值的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。(2)APPZ霧化給藥5天后小鼠BALF中總蛋白濃度,與模型組(552.99±217.47μg/ml)相比地塞米松組(382.69±63.80μg/ml)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);TNF-a的濃度,同模型組(
12、841.20±217.47μg/ml)對比,高劑量霧化組(256.31±122.88pg/ml),地塞米松組(174.80±104.85pg/ml),低劑量霧化組(478.83±147.36pg/ml)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但是IL-6的濃度和肺組織的濕干比值各組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。光鏡下肺組織的病理變化可見:模型組小鼠肺泡腔及其周圍有大量以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增厚,肺組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞,其余各組
13、小鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對完整,周圍有部分炎癥細(xì)胞浸潤,其中霧化給藥5天的小鼠同霧化給藥3天的小鼠肺組織病理觀察比較,肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤相對較少,肺泡腔清晰可見。
結(jié)論:
APPZ給予小鼠灌胃后,無明顯急性毒性反應(yīng),說明其毒性較低;氣管酚紅排泄實驗結(jié)果顯示,藥物高劑量組與祛痰劑--氯化銨的作用結(jié)果無顯著性差異,說明APPZ有顯著的祛痰作用;觀察APPZ灌胃及霧化吸入對小鼠急性氣道炎癥干預(yù)作用的實驗結(jié)果,兩種給藥方式對急性氣道炎
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