白花泡桐葉和莖的cDNA--SRAP差異表達(dá)分析.pdf

1、泡桐作為一種快速增長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，從屬于玄參科（Scrophulariaceae），原產(chǎn)于我國(guó)。其物種資源豐富，分布廣泛，在木材加工應(yīng)用、生態(tài)觀賞及醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究方面有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益。葉作為泡桐的重要器官，通過(guò)光合作用和呼吸作用為植株提供生長(zhǎng)發(fā)育所需要的能量，同時(shí)儲(chǔ)存養(yǎng)分和有機(jī)物，對(duì)泡桐的生命活動(dòng)起著重要的作用。研究葉在林木生長(zhǎng)發(fā)育中基因表達(dá)的相關(guān)情況，為泡桐生長(zhǎng)發(fā)育基因工程探索提供有效數(shù)據(jù)。cDNA-SRAP（cDNA-seq

2、uence-related amplified polymorphism）技術(shù)作為一種適用于差異表達(dá)分析的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，其操作簡(jiǎn)便、試驗(yàn)程序簡(jiǎn)單，重復(fù)性強(qiáng)、試驗(yàn)成本低，可以多個(gè)樣本間進(jìn)行比較分析，在沒(méi)有己知序列的前提下，仍可進(jìn)行差異比對(duì)分析，具有高頻共顯性標(biāo)記。本試驗(yàn)采用cDNA-SRAP技術(shù)嘗試對(duì)泡桐葉和莖進(jìn)行差異分析，以期在基因表達(dá)層面上了解泡桐組織器官間差異及葉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況，探索其可能在泡桐生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制

3、。具體研究結(jié)果如下:
　　1)通過(guò)cDNA-SRAP分子標(biāo)記技術(shù)方法的研究，以提取的白花泡桐RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈為反應(yīng)模板，根據(jù)其技術(shù)原理，從64對(duì)設(shè)計(jì)的引物序列中篩選出25對(duì)擴(kuò)增較好的適用于泡桐差異表達(dá)分析的引物組合。cDNA-SRAP反應(yīng)體系總體積為25μL:10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,cDNA模板0.5μL,dNTP2.5mmol·L-11μL,Taq DNA polymerase5U·μL

4、-10.2μL，正向反向引物各0.5μL，雙蒸H2O19.8μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;94℃變性45s，36℃復(fù)性45s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃修復(fù)延伸10min，4℃終止反應(yīng)保存。
　　2)通過(guò)對(duì)白花泡桐葉和莖在篩選出的25對(duì)引物下進(jìn)行重復(fù)二次SRAP反應(yīng)體系擴(kuò)增中的差異片段進(jìn)行分析，最終從中篩選出23條有明顯差異表達(dá)的條帶，片段長(zhǎng)度主要在400～1700bp之間，兩次PCR擴(kuò)增重復(fù)率為

5、66.8％，其中6條在葉中單獨(dú)表達(dá)，15條與莖相比高表達(dá)。將差異條帶進(jìn)行切膠回收、并進(jìn)行克隆測(cè)序，在NCBl系統(tǒng)中進(jìn)行BLASTX同源性比對(duì)分析，其中有近70％的差異片段測(cè)序結(jié)果與已知蛋白序列有較高的同源性，包含能量與代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞壁相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)與脅迫響應(yīng)及復(fù)合影響等多個(gè)方面。
　　3)選取差異片斷對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，驗(yàn)證cDNA-SRAP結(jié)果的準(zhǔn)確性，運(yùn)用相對(duì)定量分析方法及2-(ΔΔCt)計(jì)算方法，選取管家