油菜矮化突變體莖段伸長初期莖尖差異表達(dá)基因的初步分析.pdf

1、“NDF-1”是利用快中子轟擊及硫酸二乙酯(DES)聯(lián)合處理甘藍(lán)型油菜高稈品系，然后再自交純合后育成的矮化突變體，其株高僅及親本的三分之一?！癗DF-1”在油菜抗倒伏及半矮稈雜交種選育中具有重要的作用。本文應(yīng)用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜矮化突變體“NDF-1”莖段伸長初期的抑制性消減文庫，對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，為探究油菜矮化突變的分子機理及克

2、隆該基因應(yīng)用于油菜品種基因工程改良奠定基礎(chǔ)。 首先，應(yīng)用SSH技術(shù)，以矮稈突變株系“NDF-1”為Tester、高稈野生型“3529”為Driver，構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜矮化突變體“NDF-1”莖段伸長初期莖尖的抑制性消減文庫。經(jīng)菌落PCR檢測，消減文庫的有效重組率為58％，其中插入的cDNA片段大小在100 bp到500bp之間。通過斑點雜交對88個隨機挑選的含有插入片段的陽性克隆進(jìn)行初步差異篩選，然后選取了30個陽性克隆進(jìn)行序列

3、測定。除7個克隆未出現(xiàn)測序結(jié)果外，其余克隆均獲得了DNA序列結(jié)果。對cDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較。其中13個有比較明確的比對結(jié)果：其中1個和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，2個和植物抗病性有關(guān)，1個和蛋白質(zhì)的泛素化降解有關(guān)，1個和脂肪酸轉(zhuǎn)運有關(guān)；另外有8個克隆為功能未知的蛋白質(zhì)。 其次，在SSH文庫克隆序列分析的基礎(chǔ)上，以甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)矮化突變體“NDF-1”莖尖為材料提取RNA，采用RACE技術(shù)

4、對編碼幾丁質(zhì)酶基因的G6克隆的3’端片段進(jìn)行了RACE擴增，獲得3’端片段序列長度為344bp，在GenBank中進(jìn)行比對(blast)分析。結(jié)果表明，與幾丁質(zhì)酶基因核苷酸和蛋白質(zhì)同源性分別為86％和84％。根據(jù)G6克隆的已知序列設(shè)計特異引物并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和PCR技術(shù)，檢測其在野生型與矮化突變體不同部位的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，該基因僅在矮化突變體莖尖部位有比較明顯的表達(dá)；在矮化突變體根、莖、子葉和成熟葉片部位無表達(dá)；在野生型根