人表皮生長因子hEGF在螺旋藻中的表達(dá)研究.pdf

1、表皮生長因子(Epidermal Growth Factot，EGF)是由53個(gè)氨基酸組成的多肽。因具有多種生物學(xué)活性和廣泛的臨床應(yīng)用前景， EGF及其受體家族的研究成為近年來生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。螺旋藻是一類特殊的原核生物，它作為一種天然綠色食物，具有高安全性和高營養(yǎng)價(jià)值的特點(diǎn)，有著巨大的應(yīng)用開發(fā)潛力。本實(shí)驗(yàn)的目的在于實(shí)現(xiàn)人表皮生長因子在螺旋藻中的表達(dá)，省去下游的分離純化，以期開發(fā)出外敷產(chǎn)品應(yīng)用于美容和皮膚燒傷、創(chuàng)傷的治療、直接口服的

2、美容保健品。 首先，構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化的供體表達(dá)載體。根據(jù)螺旋藻密碼子的偏嗜性，設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到人表皮生長因子基因。利用NspI和NspI這兩種同尾酶，經(jīng)過多步鏈接、測(cè)序，構(gòu)建成含有四個(gè)串聯(lián)目的基因的重組載體。然后將此串聯(lián)片段插入到含有藍(lán)藻源的熱休克groESL啟動(dòng)子、rbcS polyA終止區(qū)、同源重組片段recA基因和nptII基因的質(zhì)粒中，構(gòu)建成供體表達(dá)質(zhì)粒pKREGF4。 其次，將構(gòu)建好的供體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

3、螺旋藻。我們將供體質(zhì)粒用超聲轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化鈍頂螺旋藻，通過G418篩選，得到三株具有G418抗性且生長良好的轉(zhuǎn)化藻株，分別命名為EGFA，EGFB，EGFC。以外源片段兩側(cè)引物對(duì)轉(zhuǎn)化藻株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證明目的片段已經(jīng)整合到宿主的基因組DNA中。轉(zhuǎn)化藻通過41℃熱誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE，通過Western-blot，發(fā)現(xiàn)EGFB，EGFC藻株存在與預(yù)期外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物大小相當(dāng)?shù)?.87kD左右的特異雜交帶，證實(shí)特

4、異蛋白的存在。而EGFA可能由于外源目的基因表達(dá)量過低或者基因未表達(dá)，沒有檢測(cè)到雜交信號(hào)。我們選取生長狀態(tài)較好的轉(zhuǎn)化藻EGFC進(jìn)行大量培養(yǎng)，為后期驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因藻功能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 最后，我們通過乙酸誘導(dǎo)大鼠急性胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)，初步證明轉(zhuǎn)基因螺旋藻在治療大鼠急性胃潰瘍方面有一定的功效，轉(zhuǎn)基因藻的治療效果好于野生藻，體現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因螺旋藻藻的優(yōu)越性。 本研究通過超聲轉(zhuǎn)化的方法將目的基因人表皮生長因子hEGF片段整合到螺旋藻Spi