Rock2通過β-catenin-TCF4信號通路調控SCARA5表達影響腎癌細胞增殖的研究.pdf

1、研究背景和目的：腎癌約占所有腫瘤的3％，其死亡率高達40%，近年來腎癌的發(fā)病率每年穩(wěn)步增長2~4%，增長速度較快。當前對于腎癌的治療方法，雖然醫(yī)學界一致認為腎癌根治術是可能治愈腎癌的一種方法,但這僅僅是對于那些臨床分期處于較早階段的腎癌有比較良好的效果。在臨床上仍有相當部分的患者就診時已出現了遠處轉移、靜脈癌栓等晚期表現，手術不能將體內的腫瘤完全切除，手術效果不佳，病人的5年生存率不高，即使患者進行了根治性手術切除，仍然有20%-30%

2、患者術后3年內會出現復發(fā)及轉移；再加上腎癌本身對傳統(tǒng)放、化療并不敏感，從而使得手術無法切除的晚期腎癌患者治療較為困難，預后較差。因此研究腎癌增殖的發(fā)生機制對應用越來越廣泛的分子靶向治療尤為必要。
　　Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶2（Rock2）在Rho/Rock信號傳導通路中起關鍵作用，它對腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮巨大的作用。而A類清道夫受體5型（SCARA5），與全身多種腫瘤的形成、侵襲及轉移等有關，被稱為“低調的抑癌基因”，對腫瘤

3、細胞的增殖起抑制作用。這兩個基因作用非常廣泛而重要，與人體許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。腎癌是一種增殖能力很強的腫瘤，推斷Rock2很有可能通過調節(jié)SCARA5的表達來調控腎癌細胞的增殖。前期通過基因芯片篩選在腎癌細胞中降低Rock2表達可導致SCARA5表達升高。本研究首先檢測 Rock2在臨床腎癌患者組織中的表達，同時回顧性分析這些腎癌患者的臨床特點及預后，從而分析 Rock2與腎癌患者生存率之間的關系；其次通過體外、體力實驗明確Ro

4、ck2調控SCARA5表達對腎癌細胞增殖的影響；最后探討Rock2如何調控SCARA5的分子生物學機制。
　　方法：
　　1、通過運用熒光定量 PCR、Western blot以及免疫組織化學方法檢測我院2002年1月至2010年1月行手術切除的118例腎癌組織、癌旁組織以及腎癌786-O、769-1和Caki細胞系中Rock2 mRNA及蛋白的表達水平，統(tǒng)計分析實驗結果，電話隨訪腎癌患者，并回顧性分析所有患者的臨床病理特點

5、，總結出Rock2表達與腎癌患者臨床病理特點及生存率之間的關系；
　　2、降低腎癌細胞中 Rock2的表達，利用EDU和平板克隆實驗觀察腎癌細胞增殖能力的改變；將穩(wěn)定轉染shRock2的腎癌細胞株和未轉染的腎癌細胞株建成裸鼠皮下人腎癌瘤模型，觀察荷瘤鼠皮下腫瘤的生長變化；
　　3、在沉默和過表達腎癌細胞中Rock2的表達后運用熒光定量PCR和Western blot檢測腎癌細胞中SCARA5 mRNA和蛋白表達變化；在腎癌細

6、胞中沉默Rock2表達的同時抑制SCARA5的表達及在腎癌細胞中過表達Rock2的同時增加SCARA5的表達，觀察ROCK2、SCARA5表達的變化以及腎癌細胞增殖能力的改變；
　　4、利用免疫共沉淀方法證實Rock2是否直接作用于SCARA5，western blot及熒光素酶基因報告的實驗方法證明Rock2調控SCARA5的表達是通過β-catenin/TCF4通路來實現的。
　　結果：
　　1、Rock2在71例

7、腎癌組織中呈高表達（陽性率60.2%），僅在25例癌旁組織表達（陽性率21.2%）；Rock2的陽性表達差異與腎癌患者的年齡、性別、癥狀、腫瘤大小和部位、是否有腎上腺或者組織學上的血管侵犯以及腫瘤是否有壞死無關，但與腫瘤的臨床分期、病理分級、危險系數以及腫瘤復發(fā)密切相關；該基因的陽性表達與腎癌患者中低生存率組密切相關。
　　2、將shRock2轉染到腎癌786-O細胞和769-1細胞中或者將Rock2的特異抑制劑(Y27632)加

8、入到這兩種細胞中后，腎癌細胞的增殖顯著降低；動物實驗發(fā)現沉默 Rock2表達轉染腎癌細胞后所建立的裸鼠皮下腫瘤比空白質粒對照組轉染腎癌細胞形成的皮下腫瘤在體積和重量方面都顯著降低。
　　3、實驗還發(fā)現沉默降低腎癌786-O和769-1細胞中ROCK2的表達后， SCARA5 mRNA和蛋白表達均明顯升高；而穩(wěn)定過表達ROCK2后， SCARA5mRNA和蛋白表達明顯降低。相反，降低SCARA5的表達能逆轉沉默Rock2表達引起的腎

9、癌細胞增殖能力的降低；提高SCARA5的表達能逆轉Rock2過表達引起的腎癌細胞增殖能力的增強。
　　4、免疫共沉淀、熒光素酶基因報告和Western blot證實在ROCK2調控腎癌細胞的增殖過程中Rock2不與SCARA5直接作用，它調控SCARA5的表達是通過β-catenin/TCF4信號通路來實現的。
　　結論：Rock2能夠調控腎癌細胞的增殖，它的機制是通過β-catenin/TCF4通路作用SCARA5來實現的