Rock2基因在S期檢查點(diǎn)中的信號通路作用及對肝癌細(xì)胞影響的研究.pdf

1、目的：探討沉默Rock2基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞增殖和凋亡作用的影響；分析Rock2對下游蛋白Cdc25A的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制；闡明Rock2的上游作用激酶。最終明確Rock2基因在S期檢查點(diǎn)中的信號通路作用及對肝癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。
　　 方法：一、沉默人肝癌細(xì)胞Huh-7和HepG2中Rock2的表達(dá)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Rock2 mRNA的表達(dá)水平；Western blot檢測Rock2蛋白的表達(dá)的水平；MTT比色法檢測沉

2、默Rock2后對Huh-7和HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默Rock2對Huh-7和HepG2細(xì)胞周期及早期凋亡的變化。二、Western blot檢測51對肝癌及癌旁組織中Rock2與Cdc25A的蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建并篩選shRock2干擾質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人肝細(xì)胞癌Huh-7和HepG2細(xì)胞中，Western blot檢測Cdc25A蛋白表達(dá)變化；并針對Rock2干擾序列利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行堿基突變，構(gòu)建Rock

3、2突變質(zhì)粒從而“恢復(fù)”Rock2表達(dá)，分析Cdc25A蛋白表達(dá)變化并用MTT法檢測肝癌細(xì)胞增殖的改變。Western blot檢測Rock2穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞中Chk1/Chk2蛋白的變化，免疫共沉淀及免疫熒光共定位技術(shù)分析Rock2與Cdc25A的相互作用關(guān)系。并探索Rock2通過調(diào)節(jié)Cdc25A泛素化進(jìn)而對其降解的機(jī)制。三、通過生物信息學(xué)技術(shù)分析Rock2結(jié)構(gòu)并參考相關(guān)預(yù)測軟件設(shè)計(jì)DNA損傷時(shí)被磷酸化位點(diǎn)的磷酸化多肽，制備相應(yīng)特異

4、性磷酸化抗體。Western blot檢測電離輻射(IR)誘導(dǎo)DNA損傷時(shí)Rock2磷酸化位點(diǎn)。利用RNA干擾技術(shù)降低ATR/ATM的表達(dá)并造成DNA損傷時(shí)，Western blot檢測Rock2磷酸化位點(diǎn)的變化情況。將Rock2突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Rock2穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞中并IR照射，觀察Rock2突變體對肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及Western blot結(jié)果顯示，沉默肝癌細(xì)胞系Huh-7和

5、HepG2中Rock2表達(dá)后，Rock2 mRNA以及Rock2蛋白的表達(dá)水平均明顯下降；MTT結(jié)果顯示，沉默Rock2表達(dá)后Huh-7和HepG2細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，增殖能力明顯減弱(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默Rock2表達(dá)后的Huh-7和HepG2細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；沉默Rock2表達(dá)的Huh-7和HepG2細(xì)胞，肝癌

6、細(xì)胞的早期凋亡較對照組明顯增加(P<0.05)。二、Rock2與Cdc25A蛋白在肝癌組織中較癌旁組織呈現(xiàn)高表達(dá)，而且呈現(xiàn)正相關(guān)性。肝癌細(xì)胞中穩(wěn)定低表達(dá)Rock2后，Cdc25A蛋白表達(dá)明顯下降；“恢復(fù)”Rock2表達(dá)后，Cdc25A蛋白表達(dá)增加而且肝癌細(xì)胞也出現(xiàn)增殖加快現(xiàn)象。Rock2低表達(dá)對Chk1/Chk2蛋白變化無明顯影響。免疫共沉淀表明Rock2與Cdc25A直接相互作用，免疫熒光檢測表明Rock2與Cdc25A存在共定位。R