hOGG1基因多態(tài)性與糖尿病患者冠脈病變關(guān)系及其在mtDNA過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的VECs氧化應(yīng)激修復(fù)的研究.pdf

1、第一部分 hOGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性與糖尿病患者冠脈病變的對照研究
　　目的：
　　了解糖尿病患者h(yuǎn)OGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性與冠脈病變之間的關(guān)系。方法
　　入選行冠狀動脈造影術(shù)的糖尿病患者共323例，應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測每位患者的hOGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性。同時檢測患者血糖、血脂、腎功能等生化指標(biāo)。根據(jù)患者h(yuǎn)OGG1基因Ser326Cys多態(tài)性分為3組：Cys/C

2、ys基因型組（85例）、Ser/Ser基因型組（117例）和Ser/Cys基因型組（121例）。由兩名心血管醫(yī)師對冠脈造影圖像進(jìn)行分析，按評判標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計冠脈病變支數(shù)、病變復(fù)雜程度及Gensini評分和SYNTAX評分。分析hOGG1基因Ser326Cys多態(tài)性對hOGG1 mRNA表達(dá)和血8-OHdG水平的影響，以及這種影響對冠脈病變產(chǎn)生的結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1. Cys/Cys基因型8-OhdG水平高于 Ser/Ser基

3、因型和 Ser/Cys基因型，而hOGG1mRNA水平低于 Ser/Ser基因型和 Ser/Cys基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Ser/Ser基因型與Ser/Cys基因型兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　2. Cys/Cys基因型出現(xiàn)三支病變的概率最高，Ser/Ser基因型出現(xiàn)單支病變的概率最高，但三組之間在冠脈受累支數(shù)方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　3. Cys/Cys基因型的Ge

4、nsini評分和SYNTAX評分和冠脈復(fù)雜病變概率均高于Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型之間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　hOGG1基因Ser326Cys位點多態(tài)性與糖尿病患者冠脈病變有明顯的關(guān)系，其中Cys/Cys基因型的冠脈病變可能更為嚴(yán)重。其機制可能為Cys/Cys基因型的hOGG1表達(dá)水平下降，識別

5、和切除DNA雙鏈中的8-OHdG能力降低，修復(fù)DNA氧化損傷的能力下降，從而加速動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。
　　第二部分高血糖誘導(dǎo)VECs氧化應(yīng)激及線粒DNA損傷的研究
　　目的：
　　研究高血糖對HUVECs的氧化應(yīng)激及細(xì)胞mtDNA損傷
　　方法：
　　將 HUVECs置于含有30mmol/L D-葡萄糖的 DMEM完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在高糖培養(yǎng)前及培養(yǎng)后的12h，24h，48h用倒置熒光顯微鏡觀

6、察HUVECs形態(tài)。同時，在上述各時間點檢測細(xì)胞內(nèi)ROS、8-OHdG及hOGG1 mRNA的表達(dá)水平，并檢測HUVECs的DNA及mtDNA的損傷情況。
　　結(jié)果：
　　1．在高血糖狀態(tài)下，HUVECs隨著暴露時間的延長，細(xì)胞變得明顯稀疏，體積增大，細(xì)胞輪廓逐漸變得不清晰。細(xì)胞的胞質(zhì)界限不清且胞核大小不等，染色變淡。
　　2．在高血糖狀態(tài)下，HUVECs內(nèi)8-OHdG、ROS水平隨時間的延長逐漸增高，顯示HUVECs

7、的DNA、mtDNA損傷情況也逐漸加重。同時細(xì)胞內(nèi)的hOGG1表達(dá)水平增加。
　　3．在高血糖狀態(tài)下，雖然HUVECs氧化修復(fù)過程強化，但與氧化損傷水平相比，hOGG1/ROS比值仍表現(xiàn)下降的特點。
　　結(jié)論：
　　高血糖狀態(tài)下，HUVECs內(nèi)8-OHdG、ROS水平隨暴露時間的延長逐漸增高，同時細(xì)胞內(nèi)的氧化修復(fù)過程的增強，表現(xiàn)在hOGG1表達(dá)水平增加。但在高血糖狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)自身修復(fù)能力仍低于細(xì)胞氧化損傷程度，導(dǎo)致細(xì)胞

8、發(fā)生形態(tài)、功能的改變。
　　第三部分線粒體內(nèi)hOGG1基因過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的VECs氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的研究
　　實驗一腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的線粒體內(nèi)hOGG1基因過表達(dá)HUVECs的構(gòu)建與鑒定
　　目的：
　　應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建線粒體內(nèi) hOGG1基因過表達(dá)的 HUVECs以供進(jìn)一步的研究。
　　方法：
　　分以下四步進(jìn)行：
　　1.含有線粒體靶向序列的MTS-hOGG1基因PCR擴增。
　

9、　2.質(zhì)粒載體 pENTRTM3C和目的基因 MTS-hOGG1的連接。質(zhì)粒載體pENTRTM3C和目的基因 MTS-hOGG1建立酶切體系，連接建立重組質(zhì)粒。pENTRTM3C-MTS-hOGG1行基因測序、雙酶切及PCR鑒定成功與否。
　　3.重組質(zhì)粒與腺病毒載體進(jìn)行同源重組。取重組質(zhì)粒 pENTRTM3C-MTS-hOGG1和腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST進(jìn)行重組，篩選所得到的陽性克隆子，進(jìn)行PCR鑒定。
　

10、　4.分別在 HUVECS培養(yǎng)皿中分別加入重組腺病毒 pAd/CMV/V5-DEST-MTS-hOGG1和空白腺病毒pAd/CMV/V5-GW/lacZ，并與單純的HUVECs作為對照。培養(yǎng)48h后，采用Westem blot法檢測三組HUVECs的MTS-hOGG1表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1．以pcDNA3.1(+)-MTS-hOGG1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到與插入目的片段大小一致的1200

11、bp的電泳條帶，證明質(zhì)粒重組成功。
　　2．重組質(zhì)粒 pENTRTM3C-MTS-hOGG1的構(gòu)建。經(jīng)測序檢測和插入目的片段一致，并經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后，瓊脂糖電泳出現(xiàn)一條2200bp和一條1200bp的兩條條帶，其中2200bp條帶為原質(zhì)粒pENTRTM3C的線性片段，1200bp的為插入片段。證實成功構(gòu)建重組質(zhì)pENTRTM3C-MTs-hOGG1。
　　3．重組腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-H

12、OGG1轉(zhuǎn)染的HUVECs、腺病毒載體Pad/CMV/V5-GW/lacZ轉(zhuǎn)染的HUVECs細(xì)胞及HUVECs的hOGG1/β-actin分別為1.02±0.12，0.51±0.08，0.53±0.07。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析證實重組腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1轉(zhuǎn)染的HUVECs線粒體內(nèi)hOGG1基因過表達(dá)構(gòu)建成功。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)利用腺病毒載體 pAd/CMV/V5-DEST可以成功構(gòu)建線

13、粒體hOGG1基因過表達(dá)HUVECs。
　　實驗二線粒體hOGG1基因過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的VECs氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的研究
　　目的：
　　研究線粒體 hOGG1基因過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的 HUVECs氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的影響。
　　方法：
　　分別取重組腺病毒 Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1轉(zhuǎn)染的 HUVECs（目的基因組）、腺病毒載體 Pad/CMV/V5-GW/lacZ轉(zhuǎn)染的 HUVECs細(xì)胞（

14、空白基因組）及HUVECs（空白對照組）同時置于含30mmol/L的D-葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并分別于高糖培養(yǎng)前及后12h、24h、48h分別檢測HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS、8-OHdG及線粒體膜電位變化，同時檢測HUVECs的DNA的損傷情況。
　　結(jié)果：
　　1.隨著HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的 DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)時間延長，三組HUVECs產(chǎn)生ROS、8-OHdG的含量逐漸增強(p<0.05)

15、。在相同時間點，目的基因組的HUVECs之間產(chǎn)生的ROS、8-OHdG含量低于空白基因組和空白對照組(p<0.05)，而空白基因組與空白對照組間未見統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。
　　2.各組HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的 DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)前及培養(yǎng)后12h，24h，48h后分別行JC-1熒光染色后流式細(xì)胞儀檢測，其中目的基因組紅色熒光與綠色熒光平均熒光強度比值最高(p<0.05)；而空白基因組和空白對照組紅色熒光與綠