東北地區(qū)2型糖尿病患者Glis3基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 糖尿病(DiabetesMellitus，DM)是影響全身各組織和臟器血糖代謝紊亂的疾病，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(DiabeticRetinopathy，DR)為糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是糖尿病神經(jīng)病變和微血管病變?cè)谘鄣篆h(huán)境中的病理性改變。長(zhǎng)期以來(lái)，糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制被人們不斷深入而廣泛的研究著。目前研究認(rèn)為，DR的發(fā)病機(jī)制中最重要的因素是高血糖連續(xù)不斷的刺激及某些基因的突變和缺失，這些因素逐漸促

2、使視網(wǎng)膜組織缺氧缺血、纖維增生、新生血管生成、血管通透性增加等，這些改變直接或間接的影響著DR的發(fā)展和發(fā)生。隨著糖尿病患者的不斷增加，DR的患者也逐年增加，因DR而致盲的患者也越來(lái)越多。臨床中不難發(fā)現(xiàn)，在血糖控制方面，部分患者血糖未能得到良好的控制，DR便隨即迅速發(fā)生發(fā)展。還有一部分血糖相對(duì)控制較好的患者，DR的發(fā)展也相對(duì)比較緩慢。由此看來(lái)，血糖的嚴(yán)格控制可以減輕和緩解一些DM患者DR的發(fā)展。然而某些血糖控制較好的DM患者會(huì)發(fā)生DR，某

3、些血糖控制較差的DM患者卻不發(fā)生DR，這又表明血糖的嚴(yán)格控制對(duì)DR的發(fā)生卻是無(wú)法阻止的。在發(fā)病的先后順序上，有些患者DM已經(jīng)發(fā)生幾年或者幾十年，DR才相繼發(fā)生，有些患者DM和DR幾乎是同一時(shí)間發(fā)生的，還有一些DM患者甚至到死亡也未發(fā)生DR。曾有報(bào)道表明，DR具有顯著家族聚集性及遺傳傾向。由此可見(jiàn)不僅是高血糖嚴(yán)重影響著DR的發(fā)生發(fā)展，遺傳因素在DR的發(fā)生發(fā)展中也起著不可逾越的作用，也更值得人們?nèi)ヌ剿骱脱芯?。DR是一個(gè)多基因作用的疾病，每個(gè)

4、基因中都存在著多態(tài)性現(xiàn)象，而遺傳異質(zhì)性和種族差異性也是導(dǎo)致同基因多態(tài)性表達(dá)結(jié)果不同的原因。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者從DR的病理生理方面和分子生物學(xué)角度去篩選可能影響DR發(fā)生發(fā)展的候選基因，并從基因表達(dá)調(diào)控和基因多態(tài)性方面分析DR的遺傳易感性。Glis3(Gli-similar3)是GLI樣鋅指蛋白家族的成員之一，也被稱作ZNF515(鋅指蛋白515)，編碼核內(nèi)蛋白。由于對(duì)該基因在胰腺、腎臟、肝臟、眼等重要器官中表達(dá)的研究深入，Glis3的結(jié)構(gòu)、功

5、能及臨床意義越來(lái)越受到廣大學(xué)者的關(guān)注。不少文獻(xiàn)中又表明Glis3基因與糖尿病的聯(lián)系非常緊密，此基因是目前研究發(fā)現(xiàn)的最新2型糖尿病的致病基因之一。那么該基因會(huì)和糖尿病視網(wǎng)膜病變有著怎樣的聯(lián)系，致病于糖尿病的Glis3基因是否也致病于糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一糖尿病視網(wǎng)膜病變，迄今為止還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。本研究旨在探討東北地區(qū)2型糖尿病患者Glis3基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的關(guān)聯(lián)性，將糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者、糖尿病未合并視網(wǎng)

6、膜病變(DNR)患者及正常自愿者(NC)進(jìn)行分組對(duì)照。目前人們對(duì)DR基因方面進(jìn)行越來(lái)越多的探索研究，如果能夠詳盡、準(zhǔn)確的把握Glis3基因在DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，則有助于在典型的、臨床可鑒別的癥狀出現(xiàn)之前對(duì)DR準(zhǔn)確的作出判斷和診斷，為DR的早期預(yù)防及治療提供新的手段和方法，也為其個(gè)體化診斷和基因治療開(kāi)辟了新的途徑。為探討Glis3基因在不同疾病中的關(guān)聯(lián)性，我們應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)(PCR-RFLP)對(duì)

7、選擇的兩個(gè)位點(diǎn):rs7041847和rs7034200進(jìn)行多態(tài)性分析，借此了解Glis3基因表達(dá)的差異，此基因?qū)ο嚓P(guān)性疾病的影響，為DR基因診斷及治療提供新的依據(jù)。
　　 方法：
　　 病例來(lái)源于自2011年01月-2012年03月來(lái)沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科門診及病房就診的東北地區(qū)患者，符合1999年WHO糖尿病專家委員會(huì)提出的糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，確診病史≥7年并無(wú)嚴(yán)重心腦血管疾病的漢族2型糖尿病自愿者，及漢族正常自愿者

8、。所有病例均接受糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)入組標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行詳細(xì)的病史采集，包括2型糖尿病病程、測(cè)量空腹血糖、吸煙史、飲酒史、高血壓史、測(cè)量身高、體重并計(jì)算體重指數(shù)，以及視力、眼壓、間接檢眼鏡、裂隙燈顯微鏡、熒光素眼底血管造影(FFA)等。FFA的閱片及診斷由指定的同一名眼底病專家一人獨(dú)立完成。根據(jù)患者眼底及FFA檢查結(jié)果將患者分為2型糖尿病(T2DM)合并視網(wǎng)膜病變的DR組50例，2型糖尿病未合并視網(wǎng)膜病變的DNR組50例，另外收集正常(NC

9、)組50例。對(duì)所有受試者進(jìn)行肘正中靜脈外周血2ml采集，按照全血基因組DNA提取試劑盒（由康為世紀(jì)生物科技有限公司提供）操作流程提取基因組DNA，針對(duì)選定的兩個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異性引物（由上海生工生物服務(wù)有限工程公司提供），并進(jìn)行常規(guī)PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。采用SPSS13.0版軟件包(SPSSCompany，Chicago，Illinois，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、患者的一般情況分析:D

10、R、DNR及NC組患者間性別構(gòu)成、年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，三組間可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比。DR及DNR間對(duì)比，F(xiàn)BG、BMI及高血壓患病情況、吸煙史、飲酒史等差異無(wú)顯著性，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(p＞0.05)。DR組的糖尿病病程較DNR組長(zhǎng)，差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。與NC組相對(duì)比，DR及DNR組的空腹血糖、體重指數(shù)、高血壓患病情況、吸煙史、飲酒史均有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 2、

11、所有納入研究的樣本，DNA均使用試劑盒成功提取，并經(jīng)常規(guī)PCR得到產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行酶切得到相關(guān)基因型。經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)分析基因型均符合遺傳平衡法則，具有恒定性。
　　 3、DR組Glis3基因rs7041847多態(tài)性位點(diǎn)的AA、AG、GG基因型頻率分別是50％、36％、7％，DNR組的三種基因型頻率分別是52％、30％、18％，NC組的頻率分別是80％、16％、4％。DR與NC對(duì)比，差異具有顯著性（x2=10.

12、09，p＜0.01）;DNR與NC對(duì)比，差異具有顯著性（x2=9.55，p＜0.01）;DR與DNR對(duì)比，差異無(wú)顯著性（x2=0.54，p＞0.05）。
　　 Glis3基因rs7041847多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率相對(duì)比:DR與NC對(duì)比差異具有顯著性(x2=11.66，p＜0.01);DNR與NC對(duì)比差異具有顯著性(x2=12.65，p＜0.01);DR與DNR對(duì)比，差異無(wú)顯著性（x2=0.02，p＞0.05）。在DR及DNR

13、組，G等位基因頻率均高于NC組。
　　 4、DR組Glis3基因rs7034200多態(tài)性位點(diǎn)的AA、AC、CC基因型頻率分別是46％，30％，24％，DNR組的三種基因型頻率分別是48％、28％、24％，NC組的頻率分別是78％、14％、8％。DR與NC對(duì)比，差異具有顯著性（x2=11.04，p＜0.01）;DNR與NC對(duì)比，差異具有顯著性（x2=9.90，p＜0.01）;DR與DNR對(duì)比，差異無(wú)顯著性（x2=0.06，p＞0.

14、05）。
　　 Glis3基因rs7034200多態(tài)性的等位基因頻率相對(duì)比:DR與NC對(duì)比，差異具有顯著性(x2=14.61，p＜0.01);DNR與NC對(duì)比，差異具有顯著性(x2=13.58，p＜0.01);DR與DNR對(duì)比，差異無(wú)顯著性（x2=0.02，p＞0.05）。在DR及DNR組，C等位基因頻率均高于NC組。
　　 5、經(jīng)去除危險(xiǎn)因素后，多因素非條件Logistic回歸分析顯示，rs7041847多態(tài)性AG+G

15、G是DR及T2DM的危險(xiǎn)因素(OR=2.976、95％CI=1.97-16.85;OR=2.976;95％CI=1.97-16.85)、rs7034200多態(tài)性AC+CC是DR及T2DM的危險(xiǎn)因素(OR=1.249、95％CI=1.03-12.68;OR=1.854;95％CI=1.27-9.98)。但Glis3是否會(huì)誘發(fā)或加重DR的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，本研究并未發(fā)現(xiàn)。
　　 結(jié)論：
　　 1、血壓、T2DM病程、FBG、