miR-30c-sema3A調(diào)控成年神經(jīng)再生的機(jī)理及對(duì)嗅覺(jué)和記憶的影響.pdf

1、目的：
　　1.基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選與細(xì)胞分化和軸突導(dǎo)向相關(guān)的microRNAs;
　　2.基于生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)手段，明確miR-16，miR-30c與sema3A的靶向關(guān)系;
　　3.探討miR-30c/sema3A對(duì)體內(nèi)成年室下區(qū)新生神經(jīng)元的影響;
　　4.揭示miR-30c/sema3A影響成年室下區(qū)新生神經(jīng)元的機(jī)制;
　　5.檢測(cè)miR-30c對(duì)嗅球新生神經(jīng)元的影響;
　　6.探討m

2、iR-30c/sema3A在調(diào)控成年神經(jīng)再生信號(hào)通路上的下游介導(dǎo)分子和機(jī)制;
　　7.檢測(cè)miR-30c/sema3A引起的成年神經(jīng)再生能力的改變對(duì)嗅覺(jué)和記憶的影響。
　　方法：
　　1.利用基因表達(dá)文庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO)高通量測(cè)序結(jié)果和系統(tǒng)聚類分析(Hierarchical Clustering，HCL)及自組織映射(Self-organization Mapping，SOM)

3、表達(dá)模式分析，篩選不同發(fā)育時(shí)期間的差異表達(dá)microRNAs;
　　2.構(gòu)建microRNAs上調(diào)和下調(diào)載體及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)載體，合成microRNAs mimics等，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及qRT-PCR檢測(cè)microRNAs和sema3A的表達(dá)量，確定microRNAs與sema3A基因之間的靶向關(guān)系;
　　3.構(gòu)建microRNA上調(diào)和下調(diào)慢病毒載體，進(jìn)行慢病毒包裝，通過(guò)腦立體注射技術(shù)分別將microRNA上

4、調(diào)和下調(diào)慢病毒注射到室管下區(qū)以檢測(cè)microRNA對(duì)成年室下區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)量的影響，并通過(guò)流式分選(FACS)和qRT-PCR定量技術(shù)，檢測(cè)microRNA和sema3A在此過(guò)程中對(duì)應(yīng)表達(dá)量的變化;
　　4.對(duì)成體室下區(qū)腦片和microRNA上調(diào)及下調(diào)處理的室下區(qū)原代神經(jīng)元的形態(tài)進(jìn)行分析，并利用實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)(RTCA)和流式細(xì)胞儀分別對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè);
　　5.利用BrdU對(duì)新生神經(jīng)元進(jìn)行追蹤;通過(guò)腦立體注射

5、技術(shù)將miR-30c上調(diào)和下調(diào)慢病毒分別注射到室管下區(qū)，之后對(duì)腦片的干細(xì)胞及分化細(xì)胞進(jìn)行特異性免疫熒光顯色，以檢測(cè)miR-30c對(duì)室下區(qū)微區(qū)和嗅球內(nèi)不同種系神經(jīng)元的影響;利用TUNEL試劑盒對(duì)室下區(qū)凋亡情況進(jìn)行檢測(cè);
　　6.設(shè)計(jì)GSK3β和c-myc siRNA，利用上述siRNA分別對(duì)神經(jīng)母瘤細(xì)胞Neuro2A進(jìn)行處理，隨后對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和增殖(RTCA)情況進(jìn)行檢測(cè)，并利用蛋白免疫印跡對(duì)上述處理后的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，以確定分子

6、之間的相互關(guān)系;
　　7.對(duì)miR-30c過(guò)表達(dá)和下調(diào)后所引起的嗅球整體結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行檢測(cè)，利用食物掩埋方法，檢測(cè)miR-30c表達(dá)水平變化后對(duì)嗅覺(jué)行為的影響;并利用腦立體注射技術(shù)、BrdU新生神經(jīng)元追蹤技術(shù)、條件恐懼記憶和水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)齒狀回內(nèi)miR-30c表達(dá)水平變化對(duì)海馬新生神經(jīng)元的影響及對(duì)海馬的條件記憶和空間記憶的影響。
　　結(jié)果：
　　1、篩選出能同時(shí)參與細(xì)胞增殖和軸突導(dǎo)向microRNAs
　　

7、我們基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期室下區(qū)高通量ncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，隨后對(duì)其進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)microRNA占8％(74個(gè))，對(duì)這些microRNAs進(jìn)行聚類分析和SOM表達(dá)模式分析后，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)microRNAs的表達(dá)模式有兩種(逐漸增加型:63個(gè)microRNAs;逐漸下降型:11個(gè)microRNAs)。其中miR-16和miR-30c是差異表達(dá)最為顯著的2個(gè)microRNAs，均屬于表達(dá)模式降低型microRN

8、As。隨后的生物信息學(xué)分析顯示， sema3A可以通過(guò)同時(shí)參與兩信號(hào)通路的miR-16和miR-30c而與細(xì)胞分化途徑相聯(lián)系。
　　2、miR-30c是sema3A特異的調(diào)控因子
　　通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)miR-30c能夠顯著抑制sema3A的表達(dá)(55±1.2％，p＜0.05)，當(dāng)sema3A與miR-30c結(jié)合位點(diǎn)突變后，發(fā)現(xiàn)miR-30c對(duì)sema3A的抑制性被解除(78±4％，p＞0.05)。而無(wú)論在se

9、ma3A的野生型報(bào)告系統(tǒng)還是突變型報(bào)告系統(tǒng)，miR-16對(duì)sema3A的表達(dá)均無(wú)影響。不同濃度的microRNAs mimics的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了上述結(jié)果的正確性。用上述載體和mimics處理Neuro2A細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)microRNAs和sema3A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-30的表達(dá)與sema3A呈負(fù)相關(guān)，而miR-16的表達(dá)與sema3A之間則無(wú)相關(guān)性。并且，在Neuro2A細(xì)胞中，sema3A的表達(dá)與miR

10、-30c上調(diào)載體呈現(xiàn)負(fù)相關(guān);而與miR-30c下調(diào)載體的表達(dá)趨勢(shì)高度一致。上述結(jié)果證實(shí)，miR-30c是sema3A的調(diào)控因子。
　　3、miR-30c通過(guò)負(fù)向調(diào)控sema3A的表達(dá)增加新生神經(jīng)元的數(shù)量
　　利用BrdU分別對(duì)腦立體注射有miR-30c上調(diào)和下調(diào)慢病毒的小鼠進(jìn)行新生神經(jīng)元追蹤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30c上調(diào)后可明顯促進(jìn)室下區(qū)及遷移流內(nèi)新生神經(jīng)元的數(shù)量(室下區(qū):4.59±1.74倍，p＜0.01;遷移流:8.69±

11、1.32倍，p＜0.001)，miR-30c下調(diào)后的結(jié)果與此相反。利用流式細(xì)胞儀對(duì)室下區(qū)表達(dá)miR-30c上調(diào)和下調(diào)載體的細(xì)胞進(jìn)行分選，隨后的qRT-PCR結(jié)果顯示miR-30c上調(diào)細(xì)胞中，sema3A的表達(dá)明顯降低(0.41±0.012倍，p＜0.001);miR-30c下調(diào)細(xì)胞中，sema3A的表達(dá)明顯增加(2.48±0.023倍，p＜0.001)。此結(jié)果提示，miR-30c通過(guò)負(fù)向調(diào)控sema3A來(lái)影響室下區(qū)新生神經(jīng)元的數(shù)量。

12、r>　　4、miR-30c/sema3A通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和分化途徑來(lái)影響新生神經(jīng)元數(shù)量
　　為了進(jìn)一步檢測(cè)miR-30c/sema3A是通過(guò)什么途徑來(lái)影響室下區(qū)新生神經(jīng)元的數(shù)量，我們利用miR-30c上調(diào)和下調(diào)慢病毒處理體外培養(yǎng)的室下區(qū)原代神經(jīng)元，對(duì)其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-30c上調(diào)后，室下區(qū)神經(jīng)元分化程度明顯降低，miR-30c下調(diào)后，室下區(qū)神經(jīng)元分化程度得到加強(qiáng)。體內(nèi)miR-30c上調(diào)和下調(diào)慢病毒侵染室下區(qū)腦片的細(xì)胞形

13、態(tài)也印證了以上結(jié)果。隨后，利用實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(RTCA)分別對(duì)miR-30c上調(diào)和下調(diào)載體處理的Neuro2A的增殖進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) miR-30c上調(diào)后細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)，而miR-30c下調(diào)后細(xì)胞增殖明顯降低。進(jìn)一步的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-30c上調(diào)后，可以明顯加速細(xì)胞周期的進(jìn)程。而miR-30c下調(diào)后，明顯抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程。
　　5、GSK3β/c-myc介導(dǎo)了miR-30c/sema3A的細(xì)胞增殖和分化信號(hào)通路

14、r>　　通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)和信號(hào)通路的分析，我們鎖定GSK3β/c-myc分子作為備選的miR-30c/sema3A的下游信號(hào)介導(dǎo)分子。通過(guò)siRNA分別干擾GSK3β和c-myc，對(duì)細(xì)胞增殖和形態(tài)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)GSK3β具有促進(jìn)細(xì)胞分化抑制細(xì)胞增殖的功能，而c-myc的功能與此相反;聯(lián)合miR-30c上調(diào)和下調(diào)后細(xì)胞增殖和分化的結(jié)果，及對(duì)上述處理組相應(yīng)蛋白表達(dá)情況的鑒定，我們得出miR-30c上調(diào)后負(fù)向調(diào)控sema3A的表達(dá)，sema

15、3A表達(dá)降低后，抑制GSK3β的活性，從而使c-myc Thr58位點(diǎn)磷酸化水平降低，c-myc總量增加，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖;miR-30c下調(diào)后結(jié)果與此相反。
　　6、miR-30c引起的細(xì)胞增殖分化通路對(duì)嗅球和海馬結(jié)構(gòu)和功能的影響
　　miR-30c表達(dá)水平的變化可以改變細(xì)胞增殖和分化速度，引起新生神經(jīng)元數(shù)量的變化。為了檢測(cè)miR-30c對(duì)新生神經(jīng)元遷移靶區(qū)的影響，我們分別對(duì)室下區(qū)和海馬齒狀回進(jìn)行腦立體定位顯微注射miR-

16、30c上調(diào)和下調(diào)慢病毒。BrdU新生神經(jīng)元追蹤，干細(xì)胞和分化細(xì)胞特異性免疫熒光顯色結(jié)果顯示，miR-30c上調(diào)后，各處理組較之對(duì)照組在遷移速度上無(wú)差異。室下區(qū)、嗅球及海馬齒狀回處的新生神經(jīng)元均增加，其中室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞比例增加而分化后細(xì)胞比例降低;對(duì)嗅球和海馬神經(jīng)元的檢測(cè)結(jié)果顯示，嗅球和海馬干細(xì)胞和分化細(xì)胞都有一定比例增加。miR-30c下調(diào)后結(jié)果與上述相反。進(jìn)一步的行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，室下區(qū)miR-30c下調(diào)后，其嗅覺(jué)靈敏度明顯降低(

17、p＜0.05）;海馬齒狀回處miR-30c下調(diào)后，其條件恐懼記憶及空間記憶能力也均明顯下降(p值范圍分別為:p＜0.05;p＜0.01）。而上述對(duì)應(yīng)的miR-30c上調(diào)組和對(duì)照組相比其行為學(xué)上無(wú)明顯差異。以上結(jié)果表明，miR-30c水平的變化，可以影響成年新生神經(jīng)元的再生，并且一定數(shù)量的成年新生神經(jīng)元有利于增強(qiáng)嗅覺(jué)靈敏度和改善海馬的條件和空間記憶能力。
　　結(jié)論：
　　基于以上研究，我們的結(jié)果首次揭示:1）miR-30c可以