載SDF-1α溫度敏感性水凝膠防宮腔粘連及促子宮內(nèi)膜再生修復(fù)的效果研究.pdf

1、目的:
　　宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)是一種繼發(fā)于子宮內(nèi)膜機(jī)械或感染性損傷的疾病。正常子宮內(nèi)膜修復(fù)時(shí)不會(huì)有瘢痕形成，然而當(dāng)修復(fù)機(jī)制出現(xiàn)異常，則會(huì)導(dǎo)致IUA形成。目前常采用宮腔鏡下粘連分離切除術(shù)聯(lián)合應(yīng)用人工周期刺激子宮內(nèi)膜再生的方法進(jìn)行治療，但對(duì)重度粘連的患者療效不佳，術(shù)后往往由于宮腔創(chuàng)面缺乏有效阻隔，以及子宮內(nèi)膜基底部受損導(dǎo)致修復(fù)障礙而引起粘連復(fù)發(fā)。宮腔粘連分解術(shù)后于宮腔內(nèi)放置支架，能夠部分阻

2、隔宮腔創(chuàng)面預(yù)防再粘連，但存在分離效果有限、易引起逆行感染等問題。此外，更重要的是，重度宮腔粘連往往由于子宮內(nèi)膜基底層損傷導(dǎo)致粘連復(fù)發(fā)。因此，研究更加安全、有效分隔宮腔創(chuàng)面，兼具誘導(dǎo)干細(xì)胞歸巢修復(fù)內(nèi)膜損傷的宮腔緩釋支架，是治療IUA的當(dāng)務(wù)之急。
　　材料的選擇是研究宮腔緩釋支架的基礎(chǔ)。生物可降解高分子材料是組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，其中，溫度敏感性水凝膠能對(duì)環(huán)境溫度作出智能響應(yīng)，發(fā)生溶膠相（液態(tài)）與凝膠相（半固態(tài)）的可逆性轉(zhuǎn)變?？?/p>

3、在體外低溫環(huán)境下保持液態(tài)，通過宮頸口注入宮腔后在體溫的刺激下轉(zhuǎn)變成適應(yīng)宮腔形狀的半固態(tài)，從而起到理想的屏障作用，且能負(fù)載生物活性因子，是宮腔內(nèi)緩釋材料的理想選擇。
　　近年來，有研究者把骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cellsBM-MSCs)作為種子細(xì)胞，移植到子宮內(nèi)膜損傷的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BM-MSCs可定植于正常以及損傷的子宮內(nèi)膜組織中，并可促進(jìn)小鼠子宮內(nèi)膜損傷部位的修復(fù)。然而此方法

4、在臨床應(yīng)用中存在MSCs分離、提純及擴(kuò)增困難等問題。若通過“干細(xì)胞歸巢”的方式則可避免這些問題?！皻w巢”描述了干/祖細(xì)胞的遷移特點(diǎn)，是一個(gè)多步驟協(xié)調(diào)的過程，許多細(xì)胞因子、化學(xué)因子和細(xì)胞外基質(zhì)參與其中，主要是通過一系列趨化因子-趨化因子受體效應(yīng)軸來實(shí)現(xiàn)。目前研究較廣的是CXCL12-CXCR4效應(yīng)軸，CXCL12（SDF-1）為低氧敏感性分子，當(dāng)組織缺氧時(shí)引起SDF-1表達(dá)增高，干/祖細(xì)胞循SDF-1濃度“歸巢”至損傷組織，促進(jìn)組織再生和

5、修復(fù)。
　　方法:
　　1.1 PLEL-BSA復(fù)合水凝膠的準(zhǔn)備及其蛋白緩釋實(shí)驗(yàn)
　　我們用固體PDLLA-PEG-PDLLA(PLEL)三嵌段聚合物配制了20wt％的水凝膠，升溫至37℃，測(cè)試其在體溫下發(fā)生溶膠相至凝膠相的轉(zhuǎn)變能力。然后將牛血清白蛋白(BSA)與PLEL水凝膠物理混合制成PLEL-BSA復(fù)合水凝膠，置于37℃培養(yǎng)箱中，模擬體內(nèi)環(huán)境，分時(shí)段收集釋放的BSA，測(cè)定計(jì)算BSA的釋放速率。
　　1.2

6、rhSDF-1α對(duì)BM-MSCs的趨化作用實(shí)驗(yàn)
　　分離培養(yǎng)并鑒定新西蘭兔BM-MSCs，利用transwell系統(tǒng)驗(yàn)證rhSDF-1α對(duì)BM-MSCs的趨化作用。制備PLEL-rhSDF-1α復(fù)合水凝膠用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn):11只成年新西蘭雌兔（22條子宮）分為4組:自然修復(fù)組（n=6），沿子宮長(zhǎng)軸縱形剪開，剪去子宮內(nèi)膜，止血后縫合子宮縱形切口;PLEL治療組（n=6），縫合后向?qū)m腔內(nèi)注射PLEL水凝膠;PLEL-rhSDF-1α治療組

7、(n=6)，縫合后向?qū)m腔內(nèi)注射復(fù)合rhSDF-1α的PLEL水凝膠;假手術(shù)組(n=4)，僅行開腹手術(shù)，不處理子宮，術(shù)后7天比較PLEL-rhSDF-1α治療組、單純PLEL治療組MSCs的歸巢定植情況。
　　1.3 PLEL-rhSDF-1α預(yù)防宮腔粘連及促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生修復(fù)的效果研究
　　動(dòng)物造模及分組同上，術(shù)后28天取子宮標(biāo)本行組織切片HE染色及免疫組化染色。
　　結(jié)果:
　　2.1 PLEL水凝膠相轉(zhuǎn)變特性

8、及PLEL-BSA復(fù)合水凝膠的蛋白累積釋放曲線
　　PLEL水凝膠在溫度上升至(32-35)℃時(shí)由溶膠相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)。我們?cè)隗w外模擬宮腔環(huán)境，將PLEL-BSA水凝膠凝膠化后置于37℃PBS中可保持形態(tài)超過3d，3d后發(fā)生明顯溶蝕。PLEL-BSA復(fù)合水凝膠的蛋白累積釋放曲線顯示BSA緩釋時(shí)間超過3d。
　　2.2 rhSDF-1α對(duì)BM-MSCs的趨化作用
　　體外BM-MSCs的遷移實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組為54.330±9

9、.424，兩對(duì)照組分別為26.070±7.285及27.730±6.649，可見僅transwell小室下室加入rhSDF-1α?xí)r，BM-MSCs遷移數(shù)量明顯增多，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而兩對(duì)照組間無明顯差異。
　　術(shù)后7d，治療組子宮標(biāo)本CD44及CD90免疫熒光染色顯示有MSCs歸巢至再生內(nèi)膜組織，PLEL-rhSDF-1α治療組歸巢MSCs細(xì)胞密度為(5357.7±1355.5)/mm2較PLEL治

10、療組(1496.5±650.9)/mm2約為3.6倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.3 PLEL-rhSDF-1α預(yù)防宮腔粘連及促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生修復(fù)的效果
　　術(shù)后28d，自然修復(fù)組由于宮腔粘連閉塞，而PLEL治療組和PLEL-rhSDF-1α治療組子宮形態(tài)較規(guī)則;組織切片HE染色顯示自然修復(fù)組宮腔內(nèi)無上皮樣組織出現(xiàn)，宮腔完全閉塞，而治療組有連續(xù)的上皮樣組織覆蓋宮腔;上皮細(xì)胞角蛋白染色后統(tǒng)計(jì)內(nèi)膜上皮層周長(zhǎng)與基底

11、層周長(zhǎng)之比，假手術(shù)組(1.562±0.120)明顯較其他各組大(P＜0.05)，PLEL治療組比值(0.441±0.161)較自然修復(fù)組(0.017±0.040)大(P＜0.05)，而PLEL-rhSDF-1α治療組比值(0.878±0.131)較PLEL治療組大（P＜0.05）。CD34染色后比較各組間血管密度，PLEL-rhSDF-1α治療組(14.556±3.142)與假手術(shù)組(14.037±2.942)接近(P＞0.05);兩組