銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉-舒巴坦鈉的耐藥變遷及差異蛋白組學(xué)和比較基因組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察2013-2015年廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院銅綠假單胞菌臨床菌株對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉的藥敏變遷情況。
　　2.了解銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥前后的全菌體蛋白組變化，并篩選出差異蛋白，從蛋白組學(xué)角度了解銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉的耐藥基礎(chǔ)。
　　3.了解銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥前后的基因組學(xué)變化，并找出突變位點(diǎn)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從基因組學(xué)角度進(jìn)一步明確銅綠假單胞

2、菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥的分子基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.收集2013-2015年廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室培養(yǎng)出的全部銅綠假單胞菌的相關(guān)信息，分析3年間銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉的藥敏情況，并對(duì)檢出量較大的臨床科室的銅綠假單胞菌進(jìn)行亞組分析，了解相關(guān)病區(qū)銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉的藥敏變遷。
　　2.采用亞抑菌濃度（1/2最小抑菌濃度）梯度遞增法體外誘導(dǎo)PAO1對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥

3、，并設(shè)置同步對(duì)照組，制備實(shí)驗(yàn)組（3株）和同步對(duì)照組（3株）菌株的全菌體蛋白溶液，運(yùn)用SELDI技術(shù)檢測(cè)銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥前后全菌體蛋白譜，并使用配套軟件篩選出差異蛋白。
　　3.提取實(shí)驗(yàn)組（3株）和同步對(duì)照組（3株）菌株的基因組DNA，對(duì)抽提的DNA樣本進(jìn)行堿基測(cè)序，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組菌株的堿基序列與NCBI發(fā)表的PAO1標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)，找出有意義的突變位點(diǎn)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:

4、>　　1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室2013年對(duì)培養(yǎng)出的1306株銅綠假單胞菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，其對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉敏感情況分別為敏感52.4％（684/1306），中敏26.4%（345/1306），耐藥21.2%（345/1306）；2014年對(duì)培養(yǎng)出的1149株銅綠假單胞菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，其對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉敏感情況分別為敏感54.0%（621/1149），中敏24.6%（282/1149），耐藥21.4%（246

5、/1149）；2015年對(duì)培養(yǎng)出的1101株銅綠假單胞菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，其對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉敏感情況分別為敏感53.1%（585/1101），中敏22.3%（245/1101），耐藥24.6%（271/1101）。亞組分析中分離菌株數(shù)量較多的病區(qū)有重癥監(jiān)護(hù)病房、中醫(yī)科，燒傷整形外科和呼吸內(nèi)科等病區(qū)，其中重癥監(jiān)護(hù)病房分離菌株對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥率最高。
　　2.銅綠假單胞菌野生型PAO1對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥后與同步對(duì)

6、照組相比，有26個(gè)蛋白質(zhì)高表達(dá)，分子量分別為1235Da、4439Da、4538Da、5145Da、6269Da、6569Da、8920Da、8971Da、9081Da、9213Da、9297Da、9380Da、9861Da、10126Da、10946Da、11037 Da、11138Da、11174Da、11255Da、11328Da、11522Da、11573Da、13520Da、13583Da，13647Da和13776Da；有1

7、5個(gè)蛋白質(zhì)低表達(dá)，分子量分別為3790Da、3910Da、4439Da、5734 Da、5787Da、5880Da、5946Da、6673 Da、6906Da、7576Da、7788Da、8561Da、11731Da，12276Da和12352 Da。
　　3.銅綠假單胞菌野生型PAO1對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥組（實(shí)驗(yàn)組）菌株基因組DNA堿基序列與NCBI發(fā)表的PAO1標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)有792個(gè)突變位點(diǎn)，同步對(duì)照組（

8、對(duì)照組）菌株基因組DNA堿基序列與NCBI發(fā)表的PAO1標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)有141個(gè)突變位點(diǎn)，剔除實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共同的突變位點(diǎn)，有679個(gè)位點(diǎn)僅實(shí)驗(yàn)組存在突變，對(duì)照NCBI生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)其中42個(gè)高質(zhì)量突變位點(diǎn)所在基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些突變均發(fā)生在表達(dá)酶類、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等與代謝相關(guān)的基因位點(diǎn)上。
　　結(jié)論：
　　1.2013-2015年3年間廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室培養(yǎng)出的銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮

9、鈉/舒巴坦鈉耐藥率有逐漸上升趨勢(shì)，中敏率有逐年下降趨勢(shì)，敏感率有輕微波動(dòng)，但整體波動(dòng)不大，不同病區(qū)內(nèi)分離的銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥率不同，但以重癥監(jiān)護(hù)病房分離的菌株耐藥率最高。
　　2.用蛋白質(zhì)芯片和SELDI技術(shù)對(duì)耐頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉前后的銅綠假單胞菌進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可以篩選出與銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥相關(guān)的差異蛋白質(zhì)。
　　3.銅綠假單胞菌對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥后，基因組DNA出現(xiàn)大