線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白Mic60過(guò)表達(dá)對(duì)血管紋邊緣細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用.pdf

1、目的：探討線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白Mic60過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠內(nèi)耳血管紋邊緣細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用。
　　方法：（1）取出生0-3天的新生SD大鼠耳蝸外側(cè)壁血管紋組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)純化后的邊緣細(xì)胞（MCs）在普通光學(xué)顯微鏡及免疫熒光顯微鏡下觀察、鑒定。（2）50Um/ml葡萄糖氧化酶作用邊緣細(xì)胞4hr后誘導(dǎo)MCs氧化應(yīng)激模型，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。（3）免疫熒光及Western Blot觀察Mic60在MCs中的表達(dá)及分布情況。用M

2、Cs感染預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出Mic60-GFP-Ad及GFP-Ad感染邊緣細(xì)胞的合適滴度。（4）將體外培養(yǎng)的原代MCs根據(jù)不同的處理分為四組：C組即未經(jīng)任何處理的對(duì)照組；GO組即葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)建立的氧化應(yīng)激模型組；Mic60-組即原代培養(yǎng)的MCs轉(zhuǎn)染空載病毒GFP-Ad后再經(jīng)葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型組；Mic60+組即原代培養(yǎng)的MCs轉(zhuǎn)染Mic60-GFP-Ad后再經(jīng)葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的氧化模型組。（5）流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)的ROS

3、水平，Western Blot檢測(cè)Mic60、SOD1、SOD2在MCs中的蛋白水平。
　　結(jié)果：（1）在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到MCs接種后培養(yǎng)24hr后貼壁生長(zhǎng)，單層可融合形成典型的“鋪路石”樣外觀，后期可見(jiàn)數(shù)個(gè)細(xì)胞重疊生長(zhǎng)形成的“dome”樣結(jié)構(gòu)。在免疫熒光鏡下觀察檢測(cè)到MCs上皮細(xì)胞特異性蛋白CK18表達(dá)呈陽(yáng)性。（2）50Um/ml葡萄糖氧化酶作用邊緣細(xì)胞4hr后，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比其

4、細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著上升（p<0.01）。（3）免疫熒光觀察Mic60主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，Western Blot結(jié)果表明Mic60在線(xiàn)粒體內(nèi)表達(dá)。通過(guò)MCs感染預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出Mic60-GFP-Ad及GFP-Ad的合適滴度，分別為1.2×107 PFU/ml、1.0×107 PFU/ml。免疫熒光鏡下觀測(cè)到腺病毒轉(zhuǎn)染MCs48hr后其表達(dá)較強(qiáng)且細(xì)胞狀態(tài)較好。（4）流式細(xì)胞儀檢測(cè)四組離體培養(yǎng)的MCs中ROS的水平，發(fā)現(xiàn)GO組、Mic60-

5、組ROS水平較C組均升高（p<0.01）；但Mic60+組與Mic60-組相比較ROS水平顯著降低（p<0.01）。（5）Western Blot檢測(cè)各組Mic60、SOD1、SOD2在MCs線(xiàn)粒體中的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GO組、Mic60-組Mic60、SOD1、SOD2的蛋白表達(dá)水平較C組略有升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；Mic60+組Mic60、SOD2蛋白水平較Mic60-組顯著升高（p<0.01），但SOD1表達(dá)上升不具有統(tǒng)