Th17-Treg細(xì)胞比例失衡在兒童免疫性血小板減少癥中的研究.pdf

1、研究背景：
　　免疫性血小板減少癥（primaryimmunethrombocytopenia,ITP）在兒童時(shí)期比較常見(jiàn)。為一種良性出血性疾病[1]，其發(fā)病率約為（4-5）/10萬(wàn)，臨床上以外周血血常規(guī)中血小板計(jì)數(shù)減少，伴或不伴出血癥狀為主要特點(diǎn)。目前其發(fā)病原因尚未完全清楚，診斷該疾病仍然是排除性診斷[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)ITP患兒的預(yù)后一般良好。但約10％-20%的ITP患兒雖經(jīng)正規(guī)治療，最終仍有可能向慢性ITP甚至是難治

2、性ITP轉(zhuǎn)化。因此我們?nèi)孕鑼?duì)ITP發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)行探討。
　　Th17細(xì)胞是一種新的CD4+T淋巴細(xì)胞亞型。Th17細(xì)胞可分泌多種類型的細(xì)胞因子。其中較為典型的是白介素17（IL-17）。IL-17是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。其具有多重生物學(xué)活性。IL-17一方面可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的增殖、成熟及趨化，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)多種類型的促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。另一方面又可以通過(guò)和其他一些細(xì)胞因子的相互作用，進(jìn)而引起細(xì)胞浸潤(rùn)和組

3、織破壞，影響感染、腫瘤和自身免疫疾病等的病理發(fā)展過(guò)程[4-5]。綜合各方面文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Thl7細(xì)胞與再生障礙性貧血[6-8]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[9-11]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]、銀屑病[13-14]、慢性乙型病毒性肝炎[15-17]等多種自身免疫性疾病的發(fā)生及進(jìn)展均有一定程度的相關(guān)性。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）可分為兩種類型，一種是胸腺來(lái)源的天然型CD4+CD25+Treg細(xì)胞。另一種是外周誘導(dǎo)型CD4+CD25+Treg細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)

4、Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞無(wú)論在分化上還是功能上均相互拮抗。Treg細(xì)胞主要在機(jī)體免疫防御及穩(wěn)定維護(hù)中發(fā)揮重要作用。
　　有學(xué)者提出，Treg細(xì)胞與Thl7細(xì)胞比例失衡可能是導(dǎo)致ITP發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素，但目前這方面的研究較多集中在成人ITP。兒童ITP中關(guān)于Th17/Treg細(xì)胞比例失衡的研究則相對(duì)較少，并且結(jié)論尚存在爭(zhēng)議，并無(wú)比較確切的說(shuō)法。
　　流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM）在臨床上并不少見(jiàn)。細(xì)胞或其

5、他生物離子被免疫熒光標(biāo)記后通過(guò)流動(dòng)室進(jìn)行檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)高速的細(xì)胞定量分析和分選。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是臨床上較為經(jīng)典的檢測(cè)方法。是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的標(biāo)記免疫技術(shù)。目前在臨床疾病的診斷及治療中被不斷應(yīng)用。
　　研究目的：
　　本研究采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)初診ITP患兒丙種球蛋白治療前后及健康對(duì)照組兒童外周血中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞分別占CD4+T淋

6、巴細(xì)胞的比例，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)外周血血漿中IL-17、IL-23的水平。旨在探討Th17/Treg細(xì)胞比例失衡在兒童免疫性血小板減少癥發(fā)病及治療中的作用，進(jìn)一步為ITP的靶向治療提供新的思路。
　　研究方法：
　　收集2015.05.01-2015.08.31在鄭州市某綜合性三級(jí)甲等醫(yī)院兒科門診及病房就診的ITP患兒32例作為實(shí)驗(yàn)組，同期在我院體檢的22例健康兒童作為正常對(duì)照組。所有ITP患兒的家長(zhǎng)均知情同意

7、。行骨髓穿刺檢查后，骨穿結(jié)果均符合我國(guó)2011年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。同時(shí)排除如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、白血病、骨髓衰竭性疾病等其他引起血小板減少的血液系統(tǒng)疾病，病毒性肝炎、活動(dòng)性感染及結(jié)締組織病等疾病引起的血小板減少也需要排除在外。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童年齡、性別均具有可比性。所有患兒臨床資料完整，且無(wú)家族遺傳病史。受試兒童家長(zhǎng)均知情同意。所有標(biāo)本均于標(biāo)本采集后8h內(nèi)進(jìn)行處理。合并感染的患兒應(yīng)先控制感染

8、。在感染控制后再進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)本采集。初診ITP患兒治療前、丙種球蛋白應(yīng)用后及對(duì)照組兒童分別于清晨空腹抽取肝素鈉抗凝外周血4ml。其中1ml置于干燥無(wú)酶的EP管中，以1500r/min的速度在低速離心機(jī)中離心5分鐘，然后取上清液置于-80°冰箱中放置用于ELISA測(cè)定，剩余3ml用于流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)檢測(cè)。
　?、倭魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)各組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞分別占CD4+T細(xì)胞的比例，采用ELISA法測(cè)定外周血血漿中

9、IL-17、IL-23的水平,采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)將ITP組與正常對(duì)照組進(jìn)行比較；采用直線相關(guān)方法分析相應(yīng)細(xì)胞因子與細(xì)胞所占比例間的相關(guān)性。
　?、贗TP患兒丙種球蛋白治療前后進(jìn)行Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞分別占CD4+T細(xì)胞的比例及Th17/Treg比例之間的比較；治療后的ITP患兒按效果可以分為完全反應(yīng)組、有效組、無(wú)效組、激素依賴組，將有效組與無(wú)效組之間Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞分別占CD4+T細(xì)胞的比值及Th17/Treg比

10、例進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1.初診ITP患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為（2.03±0.55）％，Th17/Treg細(xì)胞的比例為(0.99±0.58)%，均顯著高于正常對(duì)照組兒童(0.54±0.21)%、（0.71±0.35）%(P<0.05)；ITP患兒Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為(2.49±0.86)%，顯著低于同齡正常對(duì)照組（8.14±0.86)%（P<0.05）；
　　2.

11、初診ITP組患兒外周血血漿中IL-17、IL-23的水平分別為(80.75±12.98)ng/L、（13987.26±2200.18）ng/L，均顯著高于正常對(duì)照組（21.64±4.20）ng/L、（9143.31±3219.17）ng/L（P<0.05），且血漿IL-17、IL-23的水平與Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例呈正相關(guān)（r=0.54,P<0.01;r=0.46,P<0.05），與Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例呈負(fù)相關(guān)

12、(r=-0.60,P<0.01;r=-0.52,P<0.01)。
　　3.ITP患兒治療前外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為（2.03±0.55）％、Th17/Treg細(xì)胞比例為(0.99±0.58)%，均顯著高于丙種球蛋白治療后（0.96±0.45）%、（0.18±0.16）%（P<0.05）；Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為(2.49±0.86)%，顯著低于治療后（4.54±0.95）%(P<0.05)

13、。丙種球蛋白治療后ITP患兒按治療效果可分為完全反應(yīng)組、有效組、無(wú)效組，完全反應(yīng)組患兒外周血中Th17細(xì)胞的比例、Th17/Treg細(xì)胞的比值顯著低于無(wú)效組[（0.69±0.36）%）vs(1.51±0.45)%(P<0.05);（0.14±0.07）%）vs(0.52±0.27)%(P<0.05]，Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例兩者之間相比則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[(3.59±0.92)%vs（5.21±0.78)%（P>0.05）]。