減味壽胎丸對(duì)SA病證結(jié)合模型小鼠安胎機(jī)理的研究.pdf

1、目的:
　　為研究減味壽胎丸的安胎機(jī)理，用減味壽胎丸高劑量、中劑量、低劑量（以下簡稱高劑量組、中劑量組、低劑量組）、陽性對(duì)照藥環(huán)孢素(CsA)四種藥物干預(yù)自然流產(chǎn)(SA)病證結(jié)合模型小鼠，通過酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測(cè)血清白介素(IL-17)、蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察各組小鼠蛻膜、胚胎、卵巢的形態(tài)學(xué)變化，實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-qPCR)、免疫組化法(IHC)、蛋白印跡法(WB)檢測(cè)各組孕小鼠蛻膜組織

2、中IL-17、叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)、維甲酸孤核受體（RORγt）、孕激素受體PR基因與蛋白的表達(dá)差異，進(jìn)而找出減味壽胎丸在本模型中發(fā)揮安胎機(jī)制的作用靶點(diǎn)，并探討減味壽胎丸與CsA是否能逆轉(zhuǎn)SA病證結(jié)合模型小鼠存在的Th17細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Th17/Treg)平衡偏移。
　　方法:
　　1.觀察各組孕小鼠實(shí)驗(yàn)過程中的一般情況、造模及藥物干預(yù)前后的體重變化、胚胎吸收率，ELISA法檢測(cè)各組孕小鼠血清IL-1

3、7含量的差異。
　　2.RT-qPCR檢測(cè)各組孕小鼠妊娠子宮蛻膜組織中IL-17 mRNA、Foxp3 mRNA、RORγ tmRNA、PR mRNA的表達(dá)差異;HE染色法觀察各組孕小鼠蛻膜、胚胎及卵巢中卵泡與黃體的形態(tài)學(xué)差異，IHC與WB檢測(cè)各組孕小鼠IL-17、Foxp3、PR、RORγt蛋白表達(dá)的差異。
　　結(jié)果:
　　1.造模成功的標(biāo)準(zhǔn):腎虛的評(píng)價(jià):見小鼠畏寒喜暖、蜷縮拱背、體毛枯疏、失去光澤、精神萎頓、倦怠嗜

4、睡，自主活動(dòng)次數(shù)明顯減少、行動(dòng)困難，瞇眼、呼吸短促，躁動(dòng)、易驚;進(jìn)食量和飲水量下降，大便稀溏（肛門會(huì)粘有稀溏臭穢的大便）、小便清長;尾巴發(fā)涼，體溫下降、反應(yīng)遲鈍，體重增長減慢甚至下降，開口變小，消化道澀滯，灌胃困難，有食物反流于口中。部分小鼠出現(xiàn)妊娠期間陰道流血甚至胚胎的排出，符合小鼠腎虛的生理病理表現(xiàn)，提示造模成功?？瞻捉M及減味壽胎丸高、中、低劑量組和陽性對(duì)照組的小鼠一般狀態(tài)良好，體毛順滑有光澤，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，進(jìn)食、進(jìn)水量正

5、常，體重增加，組間差異不大。
　　2.妊娠第0天、第4.5天、第9天，各組孕小鼠體重?zé)o組間差異。妊娠第0天與妊娠第4.5天各組孕小鼠體重有組內(nèi)差異;妊娠第4.5天與妊娠第9天各組孕小鼠體重有組內(nèi)差異。
　　3.各組小鼠胚胎吸收率:模型1組、模型2組與空白組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0016），高劑量組與模型1組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0016）;中劑量組、低劑量組、陽性對(duì)照組與模型1組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義（P＜0.0016）;中劑量組、低劑量組、陽性對(duì)照組組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0016）。
　　4.模型1組、模型2組與空白組的孕小鼠血清IL-17水平有顯著差異（P＜0.01）;模型2組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性藥組與模型1組的孕小鼠血清IL-17水平有顯著差異（P＜0.01）;高劑量組與中劑量組、低劑量組、陽性對(duì)照組相比較，差異具有顯著性(P＜0.01);中劑量組與低劑量組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P＜0.05);中劑量與陽性對(duì)照組相比較，差異具有顯著性（P＜0.01）;低劑量組與陽性對(duì)照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.RT-qPCR結(jié)果顯示:小鼠蛻膜組織中Foxp3 mRNA、PR mRNA的表達(dá)，模型1組、模型2組較空白組明顯下調(diào)，藥物干預(yù)的四個(gè)組較模型1組的表達(dá)明顯上調(diào);IL-17 mRNA、RORγt mRNA模型1組、模型2組較空白組明顯上調(diào)，藥物干預(yù)的四個(gè)組較模型1組的表達(dá)明顯下調(diào);以上

8、藥物四個(gè)組組間上述四個(gè)基因的表達(dá)未見明顯趨勢(shì)性差異。
　　6.免疫組化結(jié)果顯示:小鼠蛻膜組織中Foxp3、PR蛋白的表達(dá)，模型1組、模型2組較空白組明顯下調(diào)，藥物干預(yù)的四個(gè)組較模型1組的表達(dá)明顯上調(diào);IL-17、RORγt蛋白模型1組、模型2組較空白組明顯上調(diào)，藥物干預(yù)的四個(gè)組較模型1組的表達(dá)明顯下調(diào)。Foxp3、IL-17蛋白的表達(dá)，藥物干預(yù)的四個(gè)組組間未見明顯趨勢(shì)性差異。中藥3個(gè)劑量組對(duì)PR、RORγ t蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)效能均優(yōu)

9、于陽性對(duì)照組，但中藥3個(gè)劑量組之間未見明顯趨勢(shì)性差異。
　　7.蛋白印跡法結(jié)果顯示:小鼠蛻膜組織中Foxp3、PR蛋白的表達(dá)，模型1組、模型2組較空白組明顯下調(diào)，藥物干預(yù)的四個(gè)組較模型1組的表達(dá)明顯上調(diào);IL-17、RORγt蛋白的表達(dá)，模型1組、模型2組較空白組明顯上調(diào)，藥物干預(yù)的四個(gè)組較模型1組的表達(dá)明顯下調(diào)。PR蛋白的表達(dá)，藥物干預(yù)的四個(gè)組組間未見趨勢(shì)性顯著差異，表明中藥3個(gè)劑量組與陽性對(duì)照組對(duì)該蛋白的調(diào)節(jié)效能相似。中藥3個(gè)

10、劑量組對(duì)Foxp3、RORγt蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)效能均優(yōu)于陽性對(duì)照組，且中藥3個(gè)劑量組對(duì)二者的調(diào)節(jié)效能呈趨勢(shì)性差異，其從高到低排序?yàn)?中劑量組＞低劑量組＞高劑量組。中藥3個(gè)劑量組對(duì)IL-17蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)效能均優(yōu)于陽性對(duì)照組，且中藥3個(gè)劑量組對(duì)二者的調(diào)節(jié)效能呈趨勢(shì)性差異，其從高到低排序?yàn)?低劑量組＞中劑量組＞高劑量組。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用羥基脲建立SA小鼠CBA/J×DBA/2病證結(jié)合模型，初步得到該模型建立的標(biāo)準(zhǔn)化

11、流程。模型組小鼠妊娠子宮蛻膜組織中存在Foxp3、PR基因與蛋白的低表達(dá)，而IL-17、RORγt基因與蛋白的優(yōu)勢(shì)性表達(dá)。
　　2.減味壽胎丸不同劑量組可以不同程度的上調(diào)Foxp3基因與蛋白的表達(dá);下調(diào)IL-17、RORγt基因與蛋白的表達(dá);上調(diào)PR基因與蛋白的表達(dá)。
　　3.根據(jù)小鼠胚胎吸收率推論:Foxp3、IL-17、PR、RORγt基因與蛋白可能為減味壽胎丸與CsA在本病證結(jié)合SA小鼠模型中發(fā)揮安胎機(jī)制的作用靶點(diǎn)。<

12、br>　　本研究提示:IL-17為Th17高特異性分泌，RORγt為Th17特異性轉(zhuǎn)錄分子，此二者的高表達(dá)代表Th17細(xì)胞因子的高表達(dá)及其優(yōu)勢(shì)性地位;Foxp3為Treg的特異性轉(zhuǎn)錄分子，F(xiàn)oxp3的高表達(dá)代表Treg細(xì)胞因子的高表達(dá)及其優(yōu)勢(shì)性地位，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在病證結(jié)合模型中，Th17細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)性表達(dá);藥物干預(yù)后這一優(yōu)勢(shì)性表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)Treg細(xì)胞因子的優(yōu)勢(shì)性表達(dá)，可見藥物干預(yù)使病證結(jié)合模型組Th17細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)性表達(dá)