mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡以及1,25(OH)2VD3的干預(yù)作用研究.pdf

1、第一部分 mTOR介導(dǎo)胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡以及1,25(OH)2VD3的保護(hù)作用研究
　　目的：證實(shí)糖毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡；探尋實(shí)驗(yàn)性胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡的最佳葡萄糖濃度；探討mTOR信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡中的作用；證實(shí)1,25(OH)2VD3對(duì)mTOR介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡的干預(yù)作用。
　　方法：本部分實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)方面內(nèi)容：
　?。?）培養(yǎng)胰島β細(xì)胞株（INS-1細(xì)胞），隨機(jī)分為：①正常葡萄糖濃度組（N

2、ormal glucose，NG）：加入葡萄糖濃度為5.5mmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；②高葡萄糖濃度組10（High glucose， HG10）：加入葡萄糖濃度為10mmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；③高葡萄糖濃度組15（High glucose，HG15）：加入葡萄糖濃度為15mmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；④高葡萄糖濃度組20（High glucose，HG20）：加入葡萄糖濃度為20mmo

3、l/L的培養(yǎng)液進(jìn)行 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；⑤高葡萄糖濃度組25（High glucose，HG25）：加入葡萄糖濃度為25mmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；⑥高葡萄糖濃度組30（High glucose，HG30）：加入葡萄糖濃度為30mmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；⑦高葡萄糖濃度組35（High glucose，HG35）：葡萄糖濃度為35mmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用倒置顯微鏡觀察原位培養(yǎng)

4、細(xì)胞形態(tài)、臺(tái)盼藍(lán)拒染、MTT、流式細(xì)胞儀分析、電鏡等方法觀察不同濃度葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)的 INS-1細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡作用的影響，觀察了不同濃度葡萄糖對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。
　?。?）結(jié)合實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）結(jié)果中的高糖濃度，培養(yǎng)胰島β細(xì)胞株（INS-1細(xì)胞），分組如下：①正常葡萄糖濃度組（NG）：葡萄糖濃度為5.5mmol/L培養(yǎng)液進(jìn)行 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；②正常葡萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組（NG+VD3）：葡萄糖濃度為5

5、.5mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；③高葡萄糖濃度組（HG）：分別加入葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；④高葡萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組（HG+ VD3）：葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）進(jìn)行 INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；⑤高葡萄糖濃度+雷帕霉素組（HG+Rap）：葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入雷帕霉素（20

6、nM）進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過Western blotting檢測(cè)高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡過程中維生素D受體、DDIT4的表達(dá)，檢測(cè)mTOR信號(hào)通路上游蛋白TSC1/2、Rheb及下游蛋白p70S6K及其磷酸化表達(dá)、mTOR及其磷酸化表達(dá)情況，并以mTOR抑制劑雷帕霉素作為干預(yù)對(duì)照。
　　結(jié)果：①倒置顯微鏡下NG組INS-1細(xì)胞呈貼壁性生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞密度增加。HG10組、HG15組INS-1細(xì)胞與NG組比較無

7、明顯變化，偶見發(fā)亮的細(xì)胞懸浮，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞密度稍有下降。HG20組、HG25組、HG30組、HG35組INS-1細(xì)胞與NG組比較細(xì)胞變小,發(fā)亮細(xì)胞懸浮,出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞密度明顯下降。
　?、谂_(tái)盼藍(lán)拒染及MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NG組、HG10組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)INS-1細(xì)胞無明顯的增殖抑制作用，HG15組在第3天開始對(duì)INS-1細(xì)胞增殖有抑制作用，與 NG組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05);HG20組、HG25組、HG30組和

8、HG35組對(duì)INS-1細(xì)胞增殖有抑制作用（P<0.05)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，增殖抑制作用越明顯（P<0.01)；IC50為HG25組。
　?、垭婄R下可見HG15組、HG20組、HG25組、HG30組和HG35組INS-1細(xì)胞在36h后與NG組比較，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，可見較多凋亡小體。
　?、?AnnexinⅤ-FITC檢測(cè)HG20組、HG25組、HG30組及HG35組凋亡率分別為10.05％、15.1%、18.22%及22.43%，顯

9、著高于NG組凋亡率1.92％（P<0.01）。而 HG30組與 HG35組細(xì)胞死亡率分別為21.72%、29.65%，明顯高于NG組細(xì)胞死亡率2.30%（P<0.01）。
　?、軳G組、NG+VD3組、HG組和HG+VD3組在24h、36h及48h時(shí)VDR蛋白表達(dá)均未見明顯差異（P>0.05）。
　　⑥HG組INS-1細(xì)胞在24h、36h及48h時(shí)DDIT4蛋白表達(dá)降低，與 NG組及 NG+VD3組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

10、P<0.01），1,25(OH)2VD3干預(yù)后（HG+VD3組），在24h、36h及48h時(shí)INS-1細(xì)胞DDIT4蛋白表達(dá)與HG組比較，增高明顯（P<0.01），接近NG組及NG+VD3組表達(dá)水平（P>0.05）。
　?、?HG組 INS-1細(xì)胞 TSC1、TSC2蛋白表達(dá)降低（P<0.05），1,25(OH)2VD3干預(yù)后（HG+VD3組），在24h、36h及48h時(shí)INS-1細(xì)胞TSC1、TSC2蛋白表達(dá)與HG組比較增高明顯

11、（P<0.01），接近NG組及NG+VD3組表達(dá)水平（P>0.05）。
　?、郒G組INS-1細(xì)胞Rheb蛋白表達(dá)明顯增高，1,25(OH)2VD3干預(yù)后（HG+VD3組），在24h、36h及48h時(shí)INS-1細(xì)胞Rheb蛋白表達(dá)與HG組比較明顯降低（P<0.01），接近NG組及NG+VD3組表達(dá)水平（P>0.05）。
　?、?HG組在24h、36h及48h時(shí)INS-1細(xì)胞mTOR蛋白及其磷酸化水平表達(dá)與NG組及NG+VD3

12、組比較均增高（P<0.01），mTOR蛋白磷酸化表達(dá)增高尤為明顯（P<0.01）。1,25(OH)2VD3干預(yù)后（HG+VD3組），在24h、36h及48h時(shí)INS-1細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)及其磷酸化水平與HG組比較明顯降低（P<0.01），接近NG組及NG+VD3組表達(dá)水平（P>0.05）。
　?、釮G組在24h、36h及48h時(shí)INS-1細(xì)胞p70S6K蛋白及其磷酸化水平表達(dá)與NG組及NG+VD3組比較均增高（P<0.01），p

13、70S6K蛋白磷酸化表達(dá)增高尤為明顯（P<0.01）。1,25(OH)2VD3干預(yù)后（HG+VD3組），在24h、36h及48h時(shí)INS-1細(xì)胞p70S6K蛋白表達(dá)及其磷酸化水平與HG組比較明顯降低（P<0.01），接近NG組及NG+VD3組表達(dá)水平（P>0.05）。
　　結(jié)論：葡萄糖濃度大于10mmol/L可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，IC50為25mmol/L，葡萄糖濃度達(dá)到25mmol/L時(shí)，胰島β細(xì)胞凋亡明顯，而細(xì)胞死亡并不顯著

14、，葡萄糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡呈時(shí)間-濃度依賴性；高糖及高糖聯(lián)合1,25(OH)2VD3干預(yù)對(duì)INS-1細(xì)胞VDR蛋白表達(dá)影響較之正常組無顯著差異。高糖降低 INS-1細(xì)胞中 DDIT4表達(dá)，而1,25(OH)2VD3可以逆轉(zhuǎn)這一作用。高糖降低INS-1細(xì)胞中TSC1、TSC2表達(dá)，以TSC2表達(dá)降低為主，高糖增高INS-1細(xì)胞中Rheb、mTOR及其磷酸化、p70S6K及其磷酸化表達(dá)，而1,25(OH)2VD3可以逆轉(zhuǎn)這一作用。高糖異常激

15、活mTOR信號(hào)通路，而1,25(OH)2VD3通過與VDR結(jié)合，增加DDIT4表達(dá)，從而增加TSC1/2表達(dá)，降低Rheb、mTOR及其磷酸化、p70S6K及其磷酸化表達(dá)，干預(yù)胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡。
　　第二部分1,25(OH)2VD3干預(yù)mTOR介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡途徑研究
　　目的：研究1,25(OH)2VD3及mTOR抑制劑雷帕霉素干預(yù)胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡作用；探討1,25(OH)2VD3干預(yù)mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)

16、的胰島β細(xì)胞糖毒性凋亡途徑。
　　方法：體外培養(yǎng)胰島β細(xì)胞INS-1，隨機(jī)化分為：①正常葡萄糖濃度組（NG）：葡萄糖濃度為5.5mmol/L培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；②正常葡萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組（ NG+VD3）：葡萄糖濃度為5.5mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；③高葡萄糖濃度組（HG）：分別加入葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；④高葡

17、萄糖濃度+1,25(OH)2VD3組（HG+VD3）：葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入1,25(OH)2VD3（10-6M）進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)；⑤高葡萄糖濃度+雷帕霉素組（HG+Rap）：葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液加入雷帕霉素（20nM）進(jìn)行INS-1細(xì)胞培養(yǎng)。
　　應(yīng)用倒置顯微鏡觀察、臺(tái)盼藍(lán)拒染、MTT、流式細(xì)胞儀分析和電鏡等方法觀察1,25(OH)2VD3干預(yù)體外培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞糖毒性凋亡的作用，并以mT

18、OR抑制劑雷帕霉素作為干預(yù)對(duì)照，通過Western blotting檢測(cè)凋亡途徑Bcl-2相關(guān)級(jí)聯(lián)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：①倒置顯微鏡下HG組INS-1細(xì)胞在24h、36h和48h與NG組比較細(xì)胞密度明顯下降，漂浮的發(fā)亮細(xì)胞較多。HG+VD3組、HG+Rap組與NG組和NG+VD3組INS-1細(xì)胞形態(tài)類似，呈貼壁性生長(zhǎng)，不規(guī)則形，大小均一，細(xì)胞密度增加。
　?、谂_(tái)盼藍(lán)拒染結(jié)果及MTT實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，HG組抑制INS-1細(xì)胞增殖，與

19、NG組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，增殖抑制作用越明顯（P<0.01)，1,25(OH)2VD3和雷帕霉素干預(yù)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖得到恢復(fù)，與 NG組及 NG+VD3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。
　　③電鏡下HG組與NG組及NG+VD3組比較，細(xì)胞體積縮小,核仁減少或消失，出現(xiàn)較多凋亡小體。1,25(OH)2VD3和雷帕霉素干預(yù)后發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞明顯減少（P<0.05)。
　?、蹵nnexinⅤ-FI

20、TC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HG組與NG組比較凋亡率增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡率增高越明顯；而HG+VD3組和HG+Rap組凋亡率與HG組比較明顯降低（P<0.05），與NG組及NG+VD3組比較無明顯改變（P>0.05）。
　　⑤ HG組在24h和36h時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)均較NG組和NG+VD3組降低（P<0.01），在48h時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)與NG組及NG+VD3組比較無明顯差異（P>0.05），但Bcl-

21、2磷酸化蛋白表達(dá)在24h、36h及48h與NG組及NG+VD3組比較明顯增高（P<0.01）。HG+VD3組和HG+Rap組在上述三個(gè)時(shí)間點(diǎn)Bcl-2蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)與NG組及NG+VD3組比較均無明顯差異（P>0.05）。
　?、轍G組在24h和36h時(shí)Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)均較NG組和NG+VD3組明顯增加（P<0.01），在48h時(shí)Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)與NG組及NG+VD3組比較無

22、明顯差異（P>0.05）。HG+VD3組和HG+Rap組在上述三個(gè)時(shí)間點(diǎn)Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)與NG組及NG+VD3組比較均無明顯差異（P>0.05）。
　　⑦HG組在24h、36h和48h時(shí)細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)均較NG組和NG+VD3組明顯增加（P<0.01），在36h時(shí)增加最為明顯。HG+VD3組和 HG+Rap組在上述三個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞色素 C蛋白表達(dá)與 NG組及NG+VD3組比較均無明顯差異（P>0.05）。<