TRAIL信號(hào)通路在大鼠腎缺血再灌注損傷中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡及米諾環(huán)素干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建大鼠腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，以下簡稱IRI)模型，觀察IRI對(duì)大鼠腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)改變的影響和細(xì)胞凋亡情況；檢測腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、半胱氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)在大鼠腎IRI模型中的表達(dá)，探討細(xì)胞凋亡與腎損傷的關(guān)系以及細(xì)胞凋亡中TRAIL和Caspase-3的作用機(jī)制；研究米諾環(huán)素在腎缺血再灌注損傷中對(duì)腎臟的保護(hù)和對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用

2、及其機(jī)制。 方法：選擇72只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為3組：對(duì)照(Control)組，缺血再灌注(IR)組，米諾環(huán)素(M)組，每組24只。各組按取腎時(shí)間不同分為4個(gè)時(shí)相(6 h，12 h，24 h，72 h)組，各時(shí)相組6只大鼠。IR組采用切除右腎，夾閉左腎動(dòng)脈45min后恢復(fù)灌流建立缺血再灌注損傷模型。Control組，僅切除右腎但不夾閉左腎動(dòng)脈。M組，手術(shù)前36h經(jīng)鼻胃管給藥(45mg/Kg)，以后每隔12h給藥1次(22.

3、5mg/Kg)，共4次，手術(shù)方法同IR組。測定血清肌酐(Scr)水平，以反映腎功能損害的程度。光學(xué)顯微鏡觀察腎組織學(xué)變化，用透射電鏡觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)的變化，了解缺血再灌注對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)的破壞。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)。免疫組化PV6001二步法檢測TRAIL和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，以探討細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制。 結(jié)果：1．Control組腎組織和超微結(jié)構(gòu)未見明顯異常；IR組腎組織出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)及超微結(jié)

4、構(gòu)損害，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞的壞死、脫落，管壁完整性的破壞，并可見凋亡細(xì)胞；M組上述損傷輕于IR組。2．IR組Scr水平于損傷后6h升高，24h達(dá)到峰值，72h后已下降，明顯高于Control組和M組。M組Scr水平明顯高于Control組。3．細(xì)胞凋亡主要分布于皮髓質(zhì)交界處，皮質(zhì)中主要分布于近曲小管。Control組腎皮質(zhì)凋亡指數(shù)僅0.71％±0.7％。IR組凋亡指數(shù)于再灌注后6H已經(jīng)增強(qiáng)(17.76％±0.9％)；24H達(dá)到峰值

5、(23.39％±1.8％)：72H已有下降(6.84％±0.9％)，均顯著高于Control組。M組細(xì)胞凋亡指數(shù)較IR組減小。Control組腎髓質(zhì)凋亡指數(shù)為0.29％±0.27％～0.65％±0.63％。IR組6H凋亡指數(shù)為44.29％±2.45％；24H表達(dá)達(dá)到峰值(49.46％±2.86％)；72H仍有表達(dá)(32.91％±3.78％)，較Control組明顯增強(qiáng)。M組細(xì)胞凋亡表達(dá)較IR組明顯減弱。4．TRAIL主要表達(dá)于皮質(zhì)近曲小

6、管。Control組腎皮質(zhì)TRAIL幾乎無表達(dá)，IOD值僅為0.000117～0.000143μm<'2>。IR組于再灌注后6H表達(dá)達(dá)0.00574±0.000477μm<'2>；24H表達(dá)高達(dá)0.0215±0.0013μm<'2>：72H時(shí)明顯下調(diào)至0.000636±0.0000439μm<'2>，均顯著高于Control組。M組TRAIL表達(dá)6H、12H、24H明顯低于IR組，但72H時(shí)與IR組相比無差異。Control組腎髓質(zhì)TR

7、AIL幾乎無表達(dá)，IOD值僅為0.000136～0.000152μm<'2>。IR組和M組IOD值也均為0.0001～0.0002μm<'2>之間，IR組和M組IOD值高于Control組，IR組和M組之間IOD值比較無明顯差異。 5．Caspase-3表達(dá)與細(xì)胞凋亡的分布一致。Control組腎皮質(zhì)Caspase-3蛋白IOD值在0.0001～0.0002～μm<'2>之間；IR組于再灌注后6H表達(dá)已經(jīng)增強(qiáng)達(dá)0.0197±0.0010

8、7μm<'2>，24H高達(dá)0.0268±0.00076μm<'2>，72H為0.0145±0.00214μm<'2>，均明顯高于Control組；M組Caspase-3蛋白表達(dá)較IR組減弱，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Control組腎髓質(zhì)Caspase-3蛋白低表達(dá)，IOD值僅為0.000096～0.000176μm<'2>之間；IR組6H為0.0238±0.00073μm<'2>，24H達(dá)到0.0307±0.00078μm<'2>，72H為0

9、.0168±0.00070μm<'2>，較Control組明顯增強(qiáng)；M組較IR組明顯減弱。6．IR組腎皮質(zhì)，細(xì)胞凋亡、TRAIL、Caspase-3三者之間都呈顯著正相關(guān)。IR組髓質(zhì)，細(xì)胞凋亡與Caspase-3呈顯著正相關(guān)，但與TRAIL無顯著相關(guān)性；Caspase-3與TRAIL也無顯著相關(guān)性。 結(jié)論：1．缺血45分鐘后再灌注，可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織學(xué)損傷，引起腎功能減退，但損傷是可逆轉(zhuǎn)的。2．腎缺血再灌注損傷模型中細(xì)胞凋亡明

10、顯增加，說明細(xì)胞凋亡參與了腎缺血再灌注損傷，且主要集中在皮髓質(zhì)交界處。3．腎缺血再灌注損傷時(shí)，TRAIL和Caspase-3均高表達(dá)于腎皮質(zhì)近曲小管，表明TRAIL、Caspase-3均參與了腎皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞凋亡的發(fā)生；髓質(zhì)中，TRAIL表達(dá)未見增強(qiáng)，Caspase-3則高表達(dá)，表明TRAIL通路未參與介導(dǎo)髓質(zhì)細(xì)胞凋亡，而是由其它通路激活Caspase-3而致細(xì)胞凋亡發(fā)生。4．米諾環(huán)素能夠減輕缺血再灌注后腎功能和腎組織結(jié)構(gòu)的損害，對(duì)腎