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文檔簡介
1、目的缺血再灌注損傷(Ischemia/Reperfusion Injury, IRI)是臨床上一種常見的病理生理現(xiàn)象,腎臟作為高灌注器官,非常容易發(fā)生IRI,臨床上因為IRI而導(dǎo)致的急性腎功能衰竭(Acute Renal Failure,ARF)的現(xiàn)象非常多見,其發(fā)病機制尚未完全清楚,且無很好的防治手段。腎缺血再灌注損傷時的病理生理變化一直是許多學(xué)者研究的重點。本研究通過制作大鼠腎缺血再灌注損傷模型,研究急性腎缺血后不同再灌注時間熱休克
2、蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表達規(guī)律及其對腎缺血再灌注損傷的保護作用,研究活血化瘀中藥對大鼠腎缺血再灌注損傷時熱休克蛋白70表達的影響,探索藥物誘導(dǎo)機體產(chǎn)生熱休克蛋白70的可行性。 方法 1、實驗分組:普通級雌性SD大鼠108只,體重200±20g隨機分為三組。A組(完全空白組):36只,按照再灌注0、6、12、24、36、48小時隨機分6小組,每組6只,分離左右兩側(cè)腎蒂,但不阻斷腎供血。B
3、組(生理鹽水組):36只,建立雙側(cè)腎蒂夾閉45分鐘的大鼠缺血再灌注模型,按照再灌注0、6、12、24、36、48小時隨機分6小組,每組6只。手術(shù)前5-10分鐘從股靜脈注射生理鹽水0.5ml/0.1kg。C組(活血化瘀中藥組):36只,建立雙側(cè)腎蒂夾閉45分鐘的大鼠缺血再灌注模型,按照再灌注0、6、12、24、36、48小時隨機分6小組,每組6只。手術(shù)前5-10分鐘從股靜脈注射活血化瘀中藥0.5ml/0.1kg,活血化瘀中藥為血必凈由天津
4、紅日藥業(yè)生產(chǎn),其主要成份:紅花、赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎。2、動物模型制作:所有手術(shù)采取配對方式進行。手術(shù)采用4﹪水合氯醛0.875ml/0.1kg腹腔注射麻醉,劍突至恥骨聯(lián)合正中切口。開腹游離左、右腎,充分顯露腎蒂,無損傷動脈夾夾閉腎蒂阻斷腎血流45min后,松開動脈夾。手術(shù)過程中觀察腎臟顏色變化,夾閉成功后腎臟顏色變成暗紅至暗黑色,打開動脈夾則短時間內(nèi)迅速再灌注充血恢復(fù)為鮮紅色。3、標(biāo)本取材: (1)造模前10分鐘及缺血再灌注結(jié)束時取
5、血待測肌酐、尿素氮。 (2)根據(jù)不同再灌注時間點結(jié)束時取一側(cè)腎放于液氮罐中保存,后放于-80℃冰箱待免疫印跡檢測使用;另一側(cè)腎立即置于10﹪福爾馬林溶液固定24小時,常規(guī)石蠟包埋,存于-4℃冰箱待做HE染色病理切片及免疫組化使用。4、結(jié)果檢測: (1)檢測A、B、C三組造模前及不同再灌注時間點的血肌酐及尿素氮的變化。(2)病理切片HE染色光鏡及電鏡照片。 (3)利用免疫印跡方法定量檢測各實驗組不同再灌注時間點HSP70的表達。 (4)免
6、疫組織化學(xué)方法定性檢測各實驗組不同再灌注時間點HSP70的表達。結(jié)果 1、血肌酐及尿素氮:A組與B組再灌注6小時以上組腎功能改變差異顯著(p<0.05),表明腎缺血再灌注損傷后出現(xiàn)急性腎功能不全;A組與C組差異不顯著(p>0.05),表明腎缺血再灌注損傷后中藥干預(yù)組腎功能破壞不顯著;B組與C組再灌注6小時以上組差異顯著(p<0.05),表明活血化瘀中藥有對抗腎缺血再灌注損傷并保護腎功能的作用。2、病理切片HE染色光鏡及電鏡照片:B組與A
7、組對比表明,腎缺血再灌注損傷后腎臟病理改變明顯;C組與B組及A組對比腎缺血再灌注損傷后腎臟病理改變減輕,表明活血化瘀中藥減輕了腎臟病理損害。3、免疫組化法定位:可見C組HSP70在細胞漿表達量較B組顯著。4、Western blot結(jié)果:與A組對比B、C組HSP70的表達隨再灌注時間延長而不斷增加,B組HSP70在再灌注24h表達達到高峰,C組HSP70表達在再灌注12h較B組提前達到高峰,表明活血化瘀中藥誘導(dǎo)HSP70表達提前達高峰發(fā)
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