低能激光對(duì)大鼠梗死心肌中microRNA-21及心室重構(gòu)影響的研究.pdf

1、研究背景和目的:心肌梗死（myocardial infarction，MI）是在冠脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生急性、持續(xù)性缺血、缺氧所引起的心肌壞死，是目前心血管疾病致死、致殘的最主要原因之一。心室重構(gòu)（ventricular remodeling，VR）發(fā)生于心肌梗死之后，因?yàn)榧?xì)胞因子、炎癥、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等機(jī)制的改變，心肌細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)形態(tài)發(fā)生改變，心臟結(jié)構(gòu)功能按照一定的模式進(jìn)行重塑，導(dǎo)致心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和血流動(dòng)力學(xué)異常，左心室發(fā)生進(jìn)行性擴(kuò)大，收

2、縮能力逐步減低，最終發(fā)生心力衰竭（heart failure，HF）或死亡，因此臨床上治療時(shí)應(yīng)該把重點(diǎn)放在抑制心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展，這已經(jīng)成為改善患者生活質(zhì)量及預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　心室重構(gòu)發(fā)展過(guò)程中受到多種編碼及非編碼基因的調(diào)控，但是至今很多基因調(diào)控機(jī)制尚不清楚。microRNA（miRNA；miR）是一類細(xì)胞內(nèi)有調(diào)控作用的小分子RNA，約由22個(gè)核苷酸組成，近期研究表明，在多種心血管疾病中miRNA均參與心臟功能和心肌重構(gòu)的調(diào)

3、控。Thum研究報(bào)道，miR-21主要調(diào)節(jié)ERK-MAP激酶信號(hào)通路，當(dāng)發(fā)生心肌梗死時(shí)，miR-21水平選擇性升高，通過(guò)抑制SPRY1調(diào)節(jié)ERK-MAP激酶信號(hào)通路，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)心室重構(gòu)。
　　低能激光照射（low level laser irradiation，LLLI）療法在醫(yī)學(xué)界發(fā)展已有60余年的歷史，此項(xiàng)療法是目前對(duì)于我們來(lái)說(shuō)，是一種已經(jīng)相當(dāng)成熟的物理治療方法，目前學(xué)術(shù)界已經(jīng)運(yùn)用各種實(shí)驗(yàn)研究、臨床探索陸續(xù)證明，此項(xiàng)療法是安

4、全有效的，它使用的是毫瓦級(jí)低能量，這種能量對(duì)靶組織實(shí)施生物學(xué)刺激，促進(jìn)了傷口愈合，同時(shí)降低炎癥反應(yīng)，并有促進(jìn)ATP的合成、加快線粒體代謝、加速細(xì)胞增殖等效果，值得說(shuō)明的是，此療法不會(huì)對(duì)組織造成損傷。最近有學(xué)者報(bào)道，LLLI處理大鼠梗死心肌，可顯著降低心肌中膠原纖維組織的合成，并且同時(shí)增加了左心室室壁的厚度。另外有研究人員實(shí)驗(yàn)證明，LLLI處理大鼠梗死心肌，心梗面積明顯縮小，梗死區(qū)微環(huán)境得到改善。
　　目前，對(duì)于LLLI處理MI后3

5、周大鼠梗死心肌組織中miR-21表達(dá)以及心室重構(gòu)過(guò)程的報(bào)道較少。鑒于此，本課題對(duì)MI后3周的大鼠梗死心肌進(jìn)行二極管低能激光照射（波長(zhǎng)為635nm），研究LLLI處理對(duì)miR-21表達(dá)以及心室重構(gòu)的影響。
　　材料和方法:
　　1.材料及分組
　　動(dòng)物選擇的是成年SD大鼠，雌性，體重220g～250g，總數(shù)為110只，按照隨機(jī)方法分為3組，分別是假手術(shù)組大鼠30只，對(duì)照組大鼠40只，治療組大鼠40只。對(duì)于對(duì)照組以及治療組

6、大鼠，心肌梗死模型的建立方法為結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支。但是假手術(shù)組在操作的時(shí)候，只在同位置穿線，不打結(jié)。
　　2.心梗模型的篩選
　　在心肌梗死模型制作后的第3周，使用超聲心動(dòng)圖對(duì)大鼠心臟進(jìn)行檢查，公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)心梗模型的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：1)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜60％；2)左室短軸縮短率（LVFS）＜30%；3)經(jīng)超聲科醫(yī)生診斷，存在1個(gè)或以上的層面發(fā)生前壁、室壁反常收縮現(xiàn)象。至少符合上述2項(xiàng)方可入選。
　　3.低能激光

7、照射處理
　　篩選工作結(jié)束后，立刻對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的梗死模型大鼠實(shí)施LLLI處理：本實(shí)驗(yàn)使用的是二極管激光治療儀，設(shè)置波長(zhǎng)為635nm，功率調(diào)節(jié)至6mW，發(fā)射器距梗死區(qū)心肌表面上方垂直距離為15mm，持續(xù)照射125s，能量密度0.96J/cm2，所有組都LLLI處理，但對(duì)照組、假手術(shù)組LLLI處理時(shí)治療儀處于關(guān)閉狀態(tài)。
　　4.miR-21的表達(dá)情況
　　每組大鼠都于LLLI后1h、24h、48h、72h、1周時(shí)，行腹腔麻醉

8、，氣管切開(kāi)并插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，迅速開(kāi)胸獲取心臟（4～6只/時(shí)間點(diǎn)），然后放進(jìn)4℃生理鹽水中，讓心臟隨著自律搏動(dòng)排空其內(nèi)的血液，小心剪下梗死中心以及邊緣的組織，把剪下的組織保存于-80℃冰箱。采用RT-qPCR方法檢測(cè)所采集組織miR-21的表達(dá)。
　　5.心功能及組織切片觀察
　　LLLI處理后1周時(shí)進(jìn)行第2次超聲檢查，評(píng)價(jià)對(duì)照組和治療組大鼠左心功能（n=4～6只/組）。此次檢查方法與第1次超聲心動(dòng)圖檢查。之后三組大鼠均

9、取取出心臟（4～6只/組），用生理鹽水充分沖洗至心腔內(nèi)無(wú)血液殘留，進(jìn)行TTC染色（2～3只/組），其余放入10％甲醛溶液中固定進(jìn)行HE染色、Masson染色、TUNEL染色，計(jì)算心梗面積、左室室壁厚度、膠原纖維含量、細(xì)胞凋亡情況。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　使用SPSS19.0軟件（美國(guó)IBM公司）進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，均數(shù)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)

10、，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.心肌梗死模型制作
　　心梗模型制備后第3周，治療組以及對(duì)照組一共剩余69只大鼠存活（86.3%），有8只大鼠在術(shù)后1周內(nèi)因心力衰竭死亡，占死亡總數(shù)的72.7%。篩選后，對(duì)照組、治療組分別有26只、27只大鼠（共53只）符合心梗模型標(biāo)準(zhǔn)（66.3%）。
　　2.梗死中心區(qū)miR-21表達(dá)
　　LLLI處理后，1h時(shí)miR-21相對(duì)表達(dá)量：對(duì)照組低于假手術(shù)

11、組（P＜0.05），治療組低于假手術(shù)組（P＜0.05），治療組高于對(duì)照組（P＜0.05）。假手術(shù)組miR-21的相對(duì)表達(dá)量總體變化甚微，對(duì)照組表達(dá)變化始于1h，之后逐漸升高。在1周時(shí)，對(duì)照組與假手術(shù)組相對(duì)表達(dá)量相近（P＞0.05）。1周時(shí)，治療組和假手術(shù)組相近（P＜0.05）。
　　3.梗死邊緣區(qū)miR-21表達(dá)
　　假手術(shù)組中miR-21相對(duì)表達(dá)量總體變化不大，對(duì)照組在1h-72h時(shí)間段內(nèi)逐漸下降，此時(shí)間段內(nèi)，對(duì)照組和假手

12、術(shù)組比較（P＜0.05），對(duì)照組miR-21相對(duì)表達(dá)量在1周時(shí)跌至最低，1周時(shí)，對(duì)照組與假手術(shù)組比較（P＞0.05）。治療組表達(dá)發(fā)生變化始于1h，此后逐漸升高，到48h時(shí)攀至最高值，在1周時(shí)降為最低值，1周時(shí)，治療組大于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　4.大鼠左室功能評(píng)價(jià)
　　治療組 LLLI處理前及處理后1周比較：LVEF（%）（39.37±1.35比47.62±2.75，P＜0.05），LVFS（%）（19.23±3.12

13、比24.15±2.53，P＜0.05）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組與治療組在LLLI處理后1周比較：LVEF（%）（39.83±1.64比47.62±2.75，P＜0.05），LVFS（%）（18.03±1.25比24.15±2.53，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.切片觀察
　　LLLI組大鼠心肌梗死面積與control組比較，減少明顯（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；左心室壁厚度比較，LLLI組和contr

14、ol組較sham組明顯減小（P＜0.05），LLLI組與control組比較，左室壁厚度明顯增加（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；左室室壁膠原纖維比較，LLLI組和control組較sham組明顯增加（P＜0.05），LLLI組較control組顯著減少（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TUNEL染色法用于檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，LLLI組和control組凋亡率明顯高于sham組（P＜0.05），LLLI組凋亡率與control