老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)特性及抗人肝癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、老鷹茶，又名豹皮樟，俗稱“白茶”，是具有安徽地域特色的中藥資源，主要分布于安徽省皖南山區(qū)。民間飲用表明老鷹茶具有解毒消腫、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效。前期的研究表明，老鷹茶總黃酮 TFLC為其活性部位，主要成分為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-β-L-鼠李糖苷這五種黃酮苷類，其在降血糖、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等

2、方面均具有顯著預(yù)防和治療作用。黃酮苷元槲皮素和山奈酚藥理作用與老鷹茶總黃酮的藥理作用相似，也具有抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用。雖然這些黃酮類化合物的很多藥理活性被研究報(bào)道，但是關(guān)于它們的吸收特點(diǎn)和機(jī)理尚不明確。
　　口服給藥是常用的給藥方式。腸道吸收作為口服藥物進(jìn)入人體的第一步，決定了藥物的生物利用度和代謝動(dòng)力學(xué)行為。構(gòu)建一種細(xì)胞體外吸收模型來模擬人體小腸上皮的功能，對(duì)闡明藥物在腸道的吸收特性，明確影響藥物吸收和生物利用度的潛在因

3、素至關(guān)重要。
　　ABC（ATP-binding cassette，ATP結(jié)合盒）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類具有ATP結(jié)合區(qū)域單向底物外排泵，主要參與細(xì)胞內(nèi)藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和外排等過程，以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式完成多種分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。目前已有研究證實(shí)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）與腫瘤細(xì)胞化療中產(chǎn)生的多藥耐藥性（mulitidrug resistance，MDR）密切相關(guān)，但具體機(jī)制不詳。
　　因此本課

4、題以Caco-2、MDCK及人肝癌耐藥細(xì)胞株為研究對(duì)象，從以下三個(gè)方面開展實(shí)驗(yàn)，研究老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其相對(duì)應(yīng)的黃酮苷元的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性，同時(shí)探討這些成分與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用及機(jī)制。
　　一、老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元在Caco-2/MDCK細(xì)胞上的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)
　　實(shí)驗(yàn)利用Caco-2和MDCK兩種細(xì)胞模型模擬人體小腸上皮，在細(xì)胞水平上研究老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其苷元的吸收特性、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理以及相互作用。

5、在實(shí)驗(yàn)考察的轉(zhuǎn)運(yùn)濃度范圍內(nèi)（40、80、160μM），山奈酚-3-O-β-L-鼠李糖苷的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)可能以被動(dòng)擴(kuò)散為主，而槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚在雙向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中都具有濃度依賴性、pH值依賴性和能量依賴性，提示它們的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程可能既有被動(dòng)擴(kuò)散，又有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。槲皮素和山奈酚具有明顯的外排現(xiàn)象，外排率ER遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2

6、。主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SGLT1）的抑制劑根皮苷對(duì)槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收有一定的促進(jìn)作用，易化擴(kuò)散蛋白（GLUT2）抑制劑根皮素對(duì)槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的吸收均有一定的促進(jìn)作用。P-糖蛋白（P-gp）抑制劑維拉帕米對(duì)于黃酮苷類的外排沒有明顯的作用，但是對(duì)其苷元槲皮素和山奈酚的外排有抑

7、制作用；而多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）抑制劑MK571和丙磺舒對(duì)于黃酮苷類和苷元的外排均有不同程度的抑制。當(dāng)這些成分兩兩相互作用后，苷元槲皮素和山奈酚可以促進(jìn)部分黃酮苷類的吸收，苷元槲皮素和山奈酚之間可以相互促進(jìn)，但是黃酮苷類之間卻沒有明顯的促進(jìn)或抑制作用。
　　二、老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類與其苷元對(duì)Caco-2細(xì)胞和人肝癌耐藥BEL-7402/5-FU細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用
　　由于 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物吸收動(dòng)

8、力學(xué)中發(fā)揮著很重要的作用，因此實(shí)驗(yàn)考察了黃酮苷類及其苷元對(duì) Caco-2細(xì)胞和人肝癌耐藥 BEL/5-FU細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MDR1/P-gp、MRP2）表達(dá)和功能活性的影響。在Caco-2細(xì)胞單層中，黃酮苷元槲皮素（40、80、160μM）和山奈酚（80、160μM）可以明顯降低轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物的外排率，但是黃酮苷類對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能沒有明顯的作用。BEL/5-FU細(xì)胞經(jīng)過苷元槲皮素（40、80、160μM）預(yù)處理后，能夠明顯下調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋

9、白基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物的熒光強(qiáng)度，作用類似于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑。同時(shí)，BEL/5-FU細(xì)胞經(jīng)過槲皮素（40、80、160μM）預(yù)處理后，能夠明顯降低5-FU的IC50值，增加細(xì)胞敏感性，逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞耐藥性。
　　三、黃酮苷元槲皮素通過抑制FZD7/β-catenin通路下調(diào)人肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥
　　近年來，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥在肝癌耐藥中占有很大的比例，

10、因此對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行干預(yù)成為逆轉(zhuǎn)肝癌化療耐藥的重要途徑。越來越多的研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間有密切的聯(lián)系。文獻(xiàn)報(bào)道Wnt蛋白的受體Frizzled(FZD)7在肝癌耐藥細(xì)胞株中過表達(dá)，作為Wnt/β-catenin通路必不可少的組成元件，F(xiàn)ZD7表達(dá)的改變可影響信號(hào)通路的調(diào)控進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。前期研究發(fā)現(xiàn)黃酮苷元槲皮素可以濃度依賴性地抑制 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能。為了考察黃酮苷元槲皮素對(duì) AB

11、C轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn) BEL-7402和BEL/5-FU細(xì)胞中FZD7、MDR1/P-gp和MRP2均異常表達(dá)，而在BEL/5-FU耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)均明顯高于其親本細(xì)胞株BEL-7402。轉(zhuǎn)染FZD7 siRNA（siFZD7）有效沉默F(xiàn)ZD7后，細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin、細(xì)胞核內(nèi)β-catenin、MDR1/P-gp、MRP2的mRNA和蛋白水平均明顯下降，5-FU、MMC和ADR的IC50值明顯下降

12、，BEL/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rh123和ADR的蓄積量增加；轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒GV144-FZD7后與siFZD7的結(jié)果相反。β-catenin的抑制劑iCRT-3也能明顯抑制下游MDR1/P-gp和MRP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。當(dāng)用不同濃度的槲皮素（40、80、160μM）處理耐藥細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯抑制FZD7、細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin、細(xì)胞核內(nèi)β-catenin、MDR1/P-gp、MRP2的mRNA和蛋白表達(dá)，具有濃度依賴性。同

13、時(shí)，與槲皮素加siFZD7的陰性對(duì)照組 sncRNA（Q+sncRNA）相比，槲皮素加siFZD7共同處理組（Q+siFZD7）可使得FZD7、細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin、細(xì)胞核內(nèi)β-catenin、MDR1/P-gp、MRP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加。提示槲皮素調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MDR1/P-gp、MRP2）的表達(dá)可能與抑制FZD7/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。
　　綜上可知，老鷹茶總黃酮中主要黃酮苷類及其苷元的吸