SATB2抑制肺癌侵襲的機(jī)制研究.pdf

1、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞像間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，是胚胎發(fā)育過程中最基本的過程，包括細(xì)胞之間的粘附力下降，細(xì)胞極性的消失，細(xì)胞獲得侵襲表型;在EMT過程中，E-cadherin被N-cadherin所取代，細(xì)胞骨架發(fā)生了重組，其中包括肌動蛋白骨架被應(yīng)力纖維取代，而細(xì)胞角蛋白中間絲被波形蛋白如Vimentin所代替。其中相應(yīng)指標(biāo)的變化也說明了細(xì)胞發(fā)生了EMT。<

2、br>　　SATB2(Special AT-rich sequence binding protein，特異AT富集序列結(jié)合蛋白)是能與核基質(zhì)附著區(qū)(Scaffold/matrix attachment regions，MARs或S/MARs)特異性結(jié)合的基因，通過與MARs結(jié)合，為轉(zhuǎn)錄因子提供結(jié)合位點(diǎn)，在調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)重組等過程中發(fā)揮重要作用。
　　SATB2蛋白主要包括兩個與核基質(zhì)結(jié)合的區(qū)域、一個C端的同源異型框、

3、兩個同義泛素相關(guān)修飾位點(diǎn)以及N端高度保守的二聚體區(qū)。SATB2通過DNA的糖-磷酸結(jié)構(gòu)與MARs結(jié)合，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)重構(gòu)來調(diào)控基因的表達(dá)，此外SATB2還可以通過直接與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作為共激活劑或者抑制物來發(fā)揮作用。SATB2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、成骨細(xì)胞分化過程以及骨基質(zhì)形成并參與腫瘤進(jìn)程。
　　近些年來SATB2在腫瘤中的研究日漸增多。SATB2在惡性乳腺癌中表達(dá)較正常組織高，且隨著腫瘤病理分級的增高而增高，與總體生存率呈負(fù)相關(guān)。

4、SATB2在頭頸部鱗癌晚期腫瘤中優(yōu)先表達(dá)，并且與ANp63α結(jié)合，調(diào)節(jié)p53家族蛋白的表達(dá)，由此表明SATB2在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。SATB2在骨肉瘤細(xì)胞和腫瘤中高表達(dá)，并且部分是通過調(diào)節(jié)EPLIN來調(diào)制肌動蛋白細(xì)胞骨架和粘著途徑來促進(jìn)骨肉瘤的侵襲。但SATB2在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)減少，并與預(yù)后不良相關(guān)。146例免疫組化發(fā)現(xiàn)SATB2的低表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后不良相關(guān)，并且與的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。Wang等人發(fā)現(xiàn)SATB2在結(jié)腸癌M5細(xì)

5、胞中是下調(diào)的，SATB2通過調(diào)控palladin的表達(dá)來抑制結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的侵襲。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中干擾SATB2后SATB1的表達(dá)增加，而過表達(dá)SATB2則能抑制SATB1表達(dá)。MicroRNA如miR-31等可以直接與SATB2的3'UTR區(qū)結(jié)合，負(fù)性調(diào)控SATB2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并且SATB2能夠逆轉(zhuǎn)miR-31誘導(dǎo)的EMT轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。文獻(xiàn)報道SATB1能夠通過EMT調(diào)控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，因此我們推測

6、SATB2可能對肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用，并且可能是通過EMT來調(diào)控。
　　文獻(xiàn)報道，SATB1參與染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成、表觀遺傳的調(diào)控以及細(xì)胞表型的形成。組蛋白修飾為表觀遺傳調(diào)控的重要的調(diào)控機(jī)制，包括甲基化、磷酸化、乙?；?、泛素化等。而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a為常染色質(zhì)主要的甲基轉(zhuǎn)移酶，通過促進(jìn)基因啟動子區(qū)組蛋白或DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄以及通過招募轉(zhuǎn)錄激活因子來激活基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。G9a能夠通過甲基化Ep-CAM啟動子區(qū)抑制

7、其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，在乳腺癌中Snail與G9a相互作用，甲基化E-cadherin的啟動子區(qū)來促進(jìn)EMT進(jìn)程，綜上:我們推測在肺癌中SATB2是否是通過影響G9a、Snail對E-cadherin啟動子區(qū)的甲基化來抑制EMT?
　　目的：
　　為了驗(yàn)證以上猜測，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):檢測肺癌標(biāo)本中SATB2表達(dá)情況，探討其與臨床病理因素之間的關(guān)系;然后在細(xì)胞系中雙向調(diào)控SATB2的表達(dá)，探討SATB2對肺癌細(xì)胞侵

8、襲作用的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.臨床資料
　　從上海芯超生物科技有限公司購買三張包含詳細(xì)病理資料的病理組織芯片，其中包括60例肺腺癌和68例肺鱗癌，共128例。
　　2.免疫組織化學(xué)技術(shù)
　　采用S-P試劑盒按照說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將組織切片放在烤箱烤2-6h后拿出，放入脫蠟用的二甲苯中(共計(jì)2h)，梯度乙醇水化，使用檸檬酸鈉修復(fù)法修復(fù)2min。然后加A液（0.3％過氧化氫）去除過

9、氧化氫酶，B液（羊血清）封閉，后加一抗SATB2抗體(Abeam公司)(1∶100)，4度孵育過夜。C液（鼠兔通用二抗）、D液后，DAB顯色約1'40”，終止顯色后用蘇木素染，鹽酸酒精分化，返藍(lán)20min，封片。結(jié)果判定:SATB2的陽性信號定位于胞核和胞漿，將SATB2的染色強(qiáng)度分為無染色為0分，染為淡黃色為1分，染為黃色或棕黃色為2分，棕褐色為3分;SATB2的陽性率也分為無著色為0，1％-25％為2分，25％-50％為3分，51％

10、-100％為4分。SATB2的染色強(qiáng)度是為兩項(xiàng)乘積值0-12，并將得分0-4定為表達(dá)陰性，得分4以上的為表達(dá)陽性。
　　3.Cell lines和細(xì)胞培養(yǎng)
　　A549、H1299和SPC-A-1(SPC)細(xì)胞系均購自于上海細(xì)胞庫。細(xì)胞系用1640或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置于CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞經(jīng)換液、消化、傳代過程，傳代三次后方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　4.轉(zhuǎn)染
　　Plncx2-SATB2質(zhì)粒以及對照質(zhì)粒均由中

11、山大學(xué)腫瘤研究中心曾木圣教授惠贈。SATB2的干擾序列以及對照均由廣州銳博合成。使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染或干擾。
　　5.Western Blot檢測
　　收集轉(zhuǎn)染、干擾或加藥后的細(xì)胞，加入含1％蛋白酶抑制劑和1％磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上裂解40min后離心，吸取上清并置于做好標(biāo)記的新的離心管中。蛋白濃度運(yùn)用Brodford法檢測，每份60ug進(jìn)行計(jì)算、配樣。蛋白電泳、轉(zhuǎn)印后，封閉。

12、特異性一抗SATB2(1∶500，abcam，UK)，E-cadherin(1;500，CST，USA)，N-cadherin(1∶500,CST，USA),β-catenin(1∶500，CST,USA),snail(1∶500，CST,USA)，slug(1∶500,CST,USA)，vimentin(1∶500,CST,USA)，G9a(1∶500，CST,USA)，H3K27me3(1∶500)，H3K9me3(1∶500)，G

13、APDH(1∶1000,Proteintech，USA)，β-actin(1∶500)，4℃過夜。使用相應(yīng)屬性的二抗，室溫2h，化學(xué)發(fā)光檢測條帶，測定灰度值。
　　6.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
　　收集轉(zhuǎn)染或干擾24h后的細(xì)胞，以每100微升含有5×105個的細(xì)胞密度接種在含2％血清的上室，下室放含有20％血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16小時后，取出24孔板，PBS洗3次后，使用預(yù)冷的冰甲醇固定，蘇木素染色，返藍(lán)。細(xì)胞計(jì)數(shù)及圖

14、片采集，選取10個視野，分別計(jì)數(shù)小室下的細(xì)胞，取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　7.免疫熒光
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染或干擾24h后，細(xì)胞爬片。第二天取出爬片，PBS先洗，多聚甲醛固定，核表達(dá)蛋白用Triton打孔，BSA或羊血清封閉，加特異性一抗過夜。第二天，洗去一抗后，避光加入相應(yīng)屬性的熒光用二抗，孵育2h，PBS洗，染核，撈片，甘油封片，照相或-20℃短期保存。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用GraphPad prim5進(jìn)行

15、數(shù)據(jù)處理:采用Chi-Square檢驗(yàn)SATB2的表達(dá)與各臨床病理因素之間的關(guān)系。Western Blot結(jié)果中的灰度值、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)數(shù)等則采用t檢驗(yàn)檢測。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.SATB2在肺癌中低表達(dá)與與臨床病理因素的關(guān)系
　　2.SATB2抑制肺癌細(xì)胞侵襲
　　3.SATB2調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達(dá)
　　4.SATB2通過G9a引起組蛋白甲基化改變
　　結(jié)論