SATB2抑制肺癌侵襲的機制研究.pdf

1、上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞像間充質細胞轉化的過程，是胚胎發(fā)育過程中最基本的過程，包括細胞之間的粘附力下降，細胞極性的消失，細胞獲得侵襲表型;在EMT過程中，E-cadherin被N-cadherin所取代，細胞骨架發(fā)生了重組，其中包括肌動蛋白骨架被應力纖維取代，而細胞角蛋白中間絲被波形蛋白如Vimentin所代替。其中相應指標的變化也說明了細胞發(fā)生了EMT。<

2、br>　　SATB2(Special AT-rich sequence binding protein，特異AT富集序列結合蛋白)是能與核基質附著區(qū)(Scaffold/matrix attachment regions，MARs或S/MARs)特異性結合的基因，通過與MARs結合，為轉錄因子提供結合位點，在調控相關基因的轉錄和染色質重組等過程中發(fā)揮重要作用。
　　SATB2蛋白主要包括兩個與核基質結合的區(qū)域、一個C端的同源異型框、

3、兩個同義泛素相關修飾位點以及N端高度保守的二聚體區(qū)。SATB2通過DNA的糖-磷酸結構與MARs結合，通過調節(jié)染色質重構來調控基因的表達，此外SATB2還可以通過直接與轉錄因子結合作為共激活劑或者抑制物來發(fā)揮作用。SATB2在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育、成骨細胞分化過程以及骨基質形成并參與腫瘤進程。
　　近些年來SATB2在腫瘤中的研究日漸增多。SATB2在惡性乳腺癌中表達較正常組織高，且隨著腫瘤病理分級的增高而增高，與總體生存率呈負相關。

4、SATB2在頭頸部鱗癌晚期腫瘤中優(yōu)先表達，并且與ANp63α結合，調節(jié)p53家族蛋白的表達，由此表明SATB2在調節(jié)細胞凋亡過程中發(fā)揮作用。SATB2在骨肉瘤細胞和腫瘤中高表達，并且部分是通過調節(jié)EPLIN來調制肌動蛋白細胞骨架和粘著途徑來促進骨肉瘤的侵襲。但SATB2在喉鱗狀細胞癌中表達減少，并與預后不良相關。146例免疫組化發(fā)現SATB2的低表達與結直腸癌的預后不良相關，并且與的侵襲轉移相關。Wang等人發(fā)現SATB2在結腸癌M5細

5、胞中是下調的，SATB2通過調控palladin的表達來抑制結腸癌HCT-116細胞的侵襲。在結直腸癌細胞中干擾SATB2后SATB1的表達增加，而過表達SATB2則能抑制SATB1表達。MicroRNA如miR-31等可以直接與SATB2的3'UTR區(qū)結合，負性調控SATB2的表達進而促進結直腸癌細胞的增殖和轉移，并且SATB2能夠逆轉miR-31誘導的EMT轉化現象。文獻報道SATB1能夠通過EMT調控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，因此我們推測

6、SATB2可能對肺癌細胞的侵襲轉移發(fā)揮作用，并且可能是通過EMT來調控。
　　文獻報道，SATB1參與染色質高級結構的形成、表觀遺傳的調控以及細胞表型的形成。組蛋白修飾為表觀遺傳調控的重要的調控機制，包括甲基化、磷酸化、乙?；⒎核鼗?。而組蛋白甲基轉移酶G9a為常染色質主要的甲基轉移酶，通過促進基因啟動子區(qū)組蛋白或DNA甲基化抑制基因轉錄以及通過招募轉錄激活因子來激活基因轉錄發(fā)揮作用。G9a能夠通過甲基化Ep-CAM啟動子區(qū)抑制

7、其表達，進而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展，在乳腺癌中Snail與G9a相互作用，甲基化E-cadherin的啟動子區(qū)來促進EMT進程，綜上:我們推測在肺癌中SATB2是否是通過影響G9a、Snail對E-cadherin啟動子區(qū)的甲基化來抑制EMT?
　　目的：
　　為了驗證以上猜測，我們進行了如下實驗:檢測肺癌標本中SATB2表達情況，探討其與臨床病理因素之間的關系;然后在細胞系中雙向調控SATB2的表達，探討SATB2對肺癌細胞侵

8、襲作用的影響及其可能的機制。
　　方法：
　　1.臨床資料
　　從上海芯超生物科技有限公司購買三張包含詳細病理資料的病理組織芯片，其中包括60例肺腺癌和68例肺鱗癌，共128例。
　　2.免疫組織化學技術
　　采用S-P試劑盒按照說明書進行免疫組織化學染色。將組織切片放在烤箱烤2-6h后拿出，放入脫蠟用的二甲苯中(共計2h)，梯度乙醇水化，使用檸檬酸鈉修復法修復2min。然后加A液（0.3％過氧化氫）去除過

9、氧化氫酶，B液（羊血清）封閉，后加一抗SATB2抗體(Abeam公司)(1∶100)，4度孵育過夜。C液（鼠兔通用二抗）、D液后，DAB顯色約1'40”，終止顯色后用蘇木素染，鹽酸酒精分化，返藍20min，封片。結果判定:SATB2的陽性信號定位于胞核和胞漿，將SATB2的染色強度分為無染色為0分，染為淡黃色為1分，染為黃色或棕黃色為2分，棕褐色為3分;SATB2的陽性率也分為無著色為0，1％-25％為2分，25％-50％為3分，51％

10、-100％為4分。SATB2的染色強度是為兩項乘積值0-12，并將得分0-4定為表達陰性，得分4以上的為表達陽性。
　　3.Cell lines和細胞培養(yǎng)
　　A549、H1299和SPC-A-1(SPC)細胞系均購自于上海細胞庫。細胞系用1640或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置于CO2培養(yǎng)箱中。細胞經換液、消化、傳代過程，傳代三次后方可進行后續(xù)實驗。
　　4.轉染
　　Plncx2-SATB2質粒以及對照質粒均由中

11、山大學腫瘤研究中心曾木圣教授惠贈。SATB2的干擾序列以及對照均由廣州銳博合成。使用轉染試劑Lipofectamine3000對細胞進行轉染或干擾。
　　5.Western Blot檢測
　　收集轉染、干擾或加藥后的細胞，加入含1％蛋白酶抑制劑和1％磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，冰上裂解40min后離心，吸取上清并置于做好標記的新的離心管中。蛋白濃度運用Brodford法檢測，每份60ug進行計算、配樣。蛋白電泳、轉印后，封閉。

12、特異性一抗SATB2(1∶500，abcam，UK)，E-cadherin(1;500，CST，USA)，N-cadherin(1∶500,CST，USA),β-catenin(1∶500，CST,USA),snail(1∶500，CST,USA)，slug(1∶500,CST,USA)，vimentin(1∶500,CST,USA)，G9a(1∶500，CST,USA)，H3K27me3(1∶500)，H3K9me3(1∶500)，G

13、APDH(1∶1000,Proteintech，USA)，β-actin(1∶500)，4℃過夜。使用相應屬性的二抗，室溫2h，化學發(fā)光檢測條帶，測定灰度值。
　　6.Transwell細胞遷移實驗
　　收集轉染或干擾24h后的細胞，以每100微升含有5×105個的細胞密度接種在含2％血清的上室，下室放含有20％血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16小時后，取出24孔板，PBS洗3次后，使用預冷的冰甲醇固定，蘇木素染色，返藍。細胞計數及圖

14、片采集，選取10個視野，分別計數小室下的細胞，取平均值。實驗重復三次。
　　7.免疫熒光
　　細胞轉染或干擾24h后，細胞爬片。第二天取出爬片，PBS先洗，多聚甲醛固定，核表達蛋白用Triton打孔，BSA或羊血清封閉，加特異性一抗過夜。第二天，洗去一抗后，避光加入相應屬性的熒光用二抗，孵育2h，PBS洗，染核，撈片，甘油封片，照相或-20℃短期保存。
　　8.統(tǒng)計學分析
　　應用GraphPad prim5進行

15、數據處理:采用Chi-Square檢驗SATB2的表達與各臨床病理因素之間的關系。Western Blot結果中的灰度值、Transwell實驗結果計數等則采用t檢驗檢測。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.SATB2在肺癌中低表達與與臨床病理因素的關系
　　2.SATB2抑制肺癌細胞侵襲
　　3.SATB2調控EMT相關蛋白表達
　　4.SATB2通過G9a引起組蛋白甲基化改變
　　結論