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文檔簡介
1、目的:
根據(jù)最新世界衛(wèi)生組織×WHO)報告,2015年全球瘧疾病例為2.14億,438,000人死于瘧疾感染,其中惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)引起的腦型瘧疾(簡稱腦瘧,cerebral malaria,CM)是重癥患者致死的主要原因。CM患者從頭痛和全身不適發(fā)展到偏癱、共濟失調(diào)、昏迷甚至死亡非常迅速。人和鼠瘧的研究均表明腦瘧的發(fā)生常伴有腦部微血管紅細胞,血小板和白細胞的滯留以及前炎癥性細胞因子的過渡
2、表達。CD4+輔助性T細胞(CD4+Th1)和CD8+細胞毒性T細胞(CD8+CTL)介導的細胞免疫應答對于誘導的實驗性腦瘧(experimental cerebralmalaria,ECM)的發(fā)生至關重要。CD4+T細胞參與ECM免疫病理的誘導期,而CD8+T細胞在腦部血管中的滯留對于ECM發(fā)展起到致病性的效應。
肥大細胞(mast cell,MC)是由骨髓多能造血干細胞分化而來,成熟的肥大細胞胞質(zhì)中含有大量具有生物活性的分
3、泌顆粒。當肥大細胞被激活時,這些預制的顆粒成分被釋放到細胞外環(huán)境中。肥大細胞通過分泌顆?;衔锇l(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能。肥大細胞廣泛分布毛細血管及淋巴管周圍。對于肥大細胞的研究主要集中于過敏性疾病,但其分布特點提示著肥大細胞在機體中起著“哨兵”的作用,是戰(zhàn)斗在抵御病原體入侵的第一道防線。已知弓形蟲等寄生蟲感染時均可引起肥大細胞增多。然而,目前肥大細胞在瘧疾感染免疫的作用尚不明確,有限的研究結果尚存明顯的相悖之處。一方面,通過對比研究肥大細
4、胞基因缺陷鼠和正常鼠,證實肥大細胞及其來源的TNF在瘧疾感染的保護機制中發(fā)揮主要作用;另一方面,瘧原蟲抗原能夠誘導人類肥大細胞系HMC-1或KU812分泌VEGF,通過導致血管異常而介導腦瘧的發(fā)生;小鼠肥大細胞來源的FIt3配體(FIt31)可以促進CD8α+DCs形成,驅(qū)動CD8+T細胞活化,從而影響瘧疾感染;組胺是肥大細胞脫顆粒產(chǎn)生的最重要的介質(zhì),惡性瘧原蟲感染時,會使血漿中中性氨基酸水平升高,引起組胺合成增加,引起相應的神經(jīng)癥狀。
5、據(jù)報道,肥大細胞可調(diào)節(jié)血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的通透性,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應。
色苷酸二鈉(disodium cromoglycate,DSCG)是一種肥大細胞穩(wěn)定劑,早在60年代就以吸入給藥的方式用于治療慢性哮喘,具有抗炎活性。本實驗利用C57BL/6小鼠感染伯氏瘧原蟲(Plasmudium.berghei ANKA,Pb ANKA)建立實驗性腦瘧模型,通過腹腔注射方式給予感染小鼠色甘
6、酸二鈉,探討其在腦瘧模型中的調(diào)控作用及機制。
方法:
1、建立實驗動物模型
6~8周齡,雌性C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔注射1×106 PbANKA寄生感染的紅細胞(PRBC),建立CM鼠瘧模型。小鼠隨機分為四組,實驗組小鼠于感染第0-5天連續(xù)腹腔給予色苷酸二鈉(10或100mg/kg),對照組給予等量生理鹽水。監(jiān)測感染率、生存率。
2、血腦屏障通透性檢測
(1)將各組小鼠靜脈注射200μl
7、2%伊文思藍染料1h
(2)腹腔注射0.4ml4%的水合氯醛,進行麻醉
(3)用生理鹽水進行心臟灌注,至流出清亮液體為準,然后取腦,拍照
(4)并將各組小鼠的腦放入離心管中,管內(nèi)加入1ml甲酰胺,37℃孵育48h
(5)將各管取出,3000rpm離心15min,取上清液200μl,至于96孔板中
(6)分光亮度計630nm檢測OD值
3、HE染色
腦組織切片標本經(jīng)4%
8、多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片,染色方法如下:
(1)石蠟切片脫蠟脫水
(2)蘇木素染色10-15min
(3)用自來水沖洗3min,然后1%鹽酸酒精分化5-10s
(4)用自來水沖洗15min反藍,然后伊紅染色3-5min
(5)用自來水沖洗3次,沖去浮色
(6)石蠟切片脫水透明
(7)用中性樹脂封片
4、腦組織組胺含量檢測
(1)
9、將腦組織加入1ml0.4 mol/L的HClO4,至于冰上勻漿后加入0.5ml H2O,混勻,15000rpm(30000Xg)15min4℃離心。
(2)吸取2.0ml上清液加入2.0ml水、0.25ml5mol/L NaOH,0.75g固體NaCl和5ml正丁醇。震搖5min將組胺抽提到正丁醇相。
(3)吸取2.0ml上清液加入2.0ml水、0.25ml5mol/L NaOH,0.75g固體NaCl和5ml正丁醇
10、。震搖5min將組胺抽提到正丁醇相。
(4)吸取丁醇相,并加入2.0ml0.1mol/L HCl和5ml的正庚烷,震搖1min后離心。組胺存在于水相中,用于熒光檢測。
(5)1ml標準液或待檢溶液轉(zhuǎn)移到試管中并加入0.4ml的1mol/L的NaOH,然后加入0.1ml1% OPT-甲醇溶液,5min后加入0.2ml的3mol/L的HCl。然后將溶液轉(zhuǎn)移至比色杯中在360nm激發(fā)波長和460nm檢測波長下進行熒光檢測。
11、
5、流式細胞術
(1)脾細胞熒光抗體染色:
無菌取出小鼠脾臟,常規(guī)制備脾細胞懸液。然后加入0.17 mol/L NH4Cl溶液裂解紅細胞。然后用含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細胞終濃度為1×107/ml。每份樣品加入100ul脾細胞懸液,經(jīng)FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體孵育、洗滌后,進行熒光抗體染色,同時設陰性對照和同種型對照。DCs檢測:用抗CD11c-FITC、抗CD11b-PE、抗CD8α
12、-Percp和抗MHCⅡ-APC單克隆抗體進行染色,4℃孵育30min,洗滌2遍后,用0.3ml細胞染色緩沖液重懸細胞,進行流式細胞儀檢測。效應性T細胞檢測:用抗CD4-FITC、抗CD44-PE、抗CD8α-Percp和抗CD62L-APC單克隆抗體進行染色,4℃孵育30min,洗滌2遍后,加入0.3ml細胞染色緩沖液重懸細胞,流式細胞儀檢測。
(2)腦組織流式細胞術:
腦組織用150目篩網(wǎng)研磨,轉(zhuǎn)移研磨后腦組織懸
13、液至5ml含有100U/mlⅣ型膠原酶的RPMI1640中,42℃水浴45分鐘。然后經(jīng)300×g水平離心10min。棄上清,收集細胞沉淀,加入2ml40% percoll重懸,混勻后加入到已加有2ml100%percoll的15ml的離心管中,2700rpm,水平離心30min,取中間層細胞,加入到15ml的EP管中,加PBS至10ml,1700rpm,離心6min,棄上清。計數(shù)細胞,并調(diào)細胞濃度至1×106/ml。取100ul腦細胞懸
14、液,經(jīng)FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體孵育、洗滌后,進行熒光抗體染色,同時設陰性對照和同種型對照。標記的熒光抗體:FITC-CD4、PE-CD11b、PerCP-CD8、APC-Gr-1和APC-cy7-CD45。4℃染色30min,PBS洗滌細胞兩次,用流式細胞儀檢測。
6、ELISA檢測
用ELISA試劑盒分別檢測血清中IL-6和IFN-γ的分泌水平。酶標儀用450nm波長測定OD值。實驗操作按照試劑盒說明書進行,結果以試劑
15、盒提供的標準品繪制標準曲線,應用SoftMax Pro4.3.1Ls軟件分析,計算細胞因子含量(pg/ml)。
7、統(tǒng)計學分析
使用Prism5.0軟件分析實驗數(shù)據(jù),標本采用兩個獨立樣本t檢驗或多個樣本one way ANOVA比較分析各組統(tǒng)計學差異,采用Kaplan-Meyer方法進行生存期分析。p<0.05為顯著差異。
結果:
1、DSCG處理后對ECM小鼠的感染率和生存期的影響
C
16、57小鼠感染腹腔注射1×106 Pb ANKA寄生紅細胞(PRBC)后,于d3在外周血圖片中可見瘧原蟲感染的紅細胞(PRBCs),隨后瘧原蟲感染率緩慢上升并維持在較低水平(<10%),感染小鼠于d5-11死亡。腹腔10mg/kgDSCG給藥組小鼠的死亡時間與對照組(PbA)無明顯差異,而腹腔100mg/kg DSCG給藥組小鼠瘧原蟲感染率逐漸升高,在感染后d17達到最高峰(~50%),于d20死于貧血。
2.、DSCG處理顯著
17、改善腦組織的病理狀況
小鼠腦組織病理學檢查顯示,PbA+DSCG組顯微鏡下每個視野中白細胞沉積的血管數(shù)明顯低于對照組。同時,檢測了各組小鼠血腦屏障的通透性,發(fā)現(xiàn)給予DSCG后能明顯抑制ECM模型中的血腦屏障通透性破壞。除此之外,我們還檢測了腦組織中組胺的含量,發(fā)現(xiàn)DSCG給藥后組胺的含量也明顯降低。
3、DSCG處理顯著減少腦組織中CD4+T和CD8+T細胞百分率
在ECM模型中,CD4+T和CD8+T細胞
18、浸潤與血腦屏障的通透性增加緊密相關。我們在小鼠感染后d5天取腦組織,研磨制備單細胞細胞懸液,F(xiàn)ACS檢測CD4+T、CD8+T細胞和中性粒細胞的比例,觀察DSCG給藥對小鼠腦組織中浸潤細胞的影響。結果顯示,DSCG給藥后腦組織CD8+T細胞的百分率顯著減少,CD4+T細胞也出現(xiàn)下降趨勢,但中性粒細胞未見明顯變化。
4、DSCG給藥后降低血清中IL-6、IFN-γ和組胺的水平
小鼠感染后d5眼球取血后分離血清,ELIS
19、A檢測血清中IL-6和IFN-γ的水平,發(fā)現(xiàn)PbA+DSCG組小鼠血清中IL-6和IFN-γ的含量與對照組相比顯著下降。小鼠感染后d5眼球取血后分離血清,分別檢測各組血清組胺的含量。結果顯示PbA+DSCG組比對照組血清組胺的含量明顯減少。
5、DSCG處理可下調(diào)脾臟DCs的成熟與活化
在小鼠感染瘧原蟲后d5,PbA組小鼠脾臟中髓樣DCs(CD11c+CD11b+)和CD8α+DC(CD8α+CD11c+)的比例顯著
20、高于PbA+DSCG組。此外表達抗原提呈分子MHCⅡ和協(xié)同刺激分子CD86分子的成熟DCs在PbA+DSCG組小鼠脾臟中的比例也顯著降低。由此可見,DSCG給藥后可抑制脾臟DCs成熟和活化。
6、DSCG處理降低脾臟效應性T細胞比例和數(shù)量
經(jīng)流式細胞術,我們檢測了小鼠感染瘧原蟲后d5脾臟效應性T細胞的比例和數(shù)量。與PbA組小鼠相比,PbA+DSCG組小鼠脾臟CD4+和CD8+的效應性T細胞(CD44+CD62L-)的
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