中藥抗肝損傷理論與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、通過(guò)文獻(xiàn)查閱，總結(jié)中醫(yī)抗肝損傷常用治則治法，同時(shí)統(tǒng)計(jì)與肝損傷相關(guān)的臨床及實(shí)驗(yàn)研究資料，總結(jié)抗肝損傷中醫(yī)臨床用藥規(guī)律以及實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展。同時(shí)在前期試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上選擇山茱萸為本實(shí)驗(yàn)的研究藥物，以D-氨基半乳糖(D-GalN)和α腫瘤壞死因子(TNF-α)聯(lián)合作用作為造成肝細(xì)胞L-02損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接懮杰镙菍?duì)于損傷肝細(xì)胞的影響以及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　一、理論研究
　　在中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“肝損傷”、“肝病”、“保肝”為關(guān)鍵詞

2、進(jìn)行搜索，總結(jié)中醫(yī)抗肝損傷的治則治法;并將復(fù)方研究文獻(xiàn)與單味藥物研究文獻(xiàn)分類整理，同時(shí)整理復(fù)方研究文獻(xiàn)中所包含的單味中藥，按照中藥學(xué)教材分類方法將復(fù)方研究文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)所涉及相關(guān)藥物進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，歸納分析治療肝損傷疾病的臨床用藥規(guī)律以及實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展。研究結(jié)果表明，肝損傷的病因多由外感濕熱疫毒、飲食不節(jié)、藥物應(yīng)用不當(dāng)，病機(jī)為肝失疏泄，脾失健運(yùn)，濕熱蘊(yùn)結(jié)，氣滯血瘀，而發(fā)為脅痛、黃疸、甚至臌脹、積聚，其病位主要在肝，關(guān)系脾、胃，久則及腎。

3、中醫(yī)治療肝損傷疾病主要以疏肝、養(yǎng)肝、健脾、和胃等方法為治療原則?？垢螕p傷復(fù)方文獻(xiàn)研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示清熱藥、補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥在肝損傷疾病的治療中應(yīng)用最為廣泛;通過(guò)對(duì)藥物歸經(jīng)的分析發(fā)現(xiàn)，抗肝損傷藥物入肝經(jīng)者最多，其次為入脾、胃經(jīng);實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，抗肝損傷藥物主要集中在補(bǔ)益藥、清熱藥、活血化瘀三類藥物。
　　山茱萸為臨床常用補(bǔ)益肝腎藥物，通過(guò)文獻(xiàn)研究，總結(jié)了山茱萸的化學(xué)成分與藥理作用，以及抗肝損傷的研究進(jìn)展。
　　二、實(shí)

4、驗(yàn)研究
　　提取并分離、制備山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside，CIG);體外培養(yǎng)人源性肝細(xì)胞L-02， MTT法建立D-GalN/TNF-α L-02細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組，模型組，環(huán)烯醚萜苷低濃度組(CIG低組)，環(huán)烯醚萜苷中濃度組(CIG中組)，環(huán)烯醚萜苷低高濃度組(CIG高組)，藥物作用結(jié)束后，用CCK-8(Cell Count kit-8)法檢測(cè)各組細(xì)胞活性;取培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按照試

5、劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)活性;采用Hochest-33258染色法，觀察各組細(xì)胞形態(tài);收集各組細(xì)胞，用流式檢測(cè)技術(shù)檢查各組細(xì)胞的凋亡比率;通過(guò)檢測(cè)各組細(xì)胞的總抗氧化能力(T-AOC)、以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的含量比較各組細(xì)胞的抗氧化能力;WesternBlot檢測(cè)各組L-02細(xì)胞p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase-3蛋白的表達(dá)，從抗氧化和

6、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡兩個(gè)方面研究山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)D-GalN/TNF-α損傷L-02細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:44μg/ml D-GalN聯(lián)合100ng/ml TNF-α作用12h可造成L-02細(xì)胞損傷，對(duì)細(xì)胞活性的抑制率達(dá)到38％。CIG不同濃度均可以顯著提高損傷細(xì)胞的活性，高、中、低濃度組與模型組比較，細(xì)胞的活性分別提高了21％、13％、8％。CIG不同濃度均可使損傷后細(xì)胞外的LDH含量顯著降低，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0

7、.05)，CIG高、中濃度可以顯著減低損傷后細(xì)胞的MDA含量(P＜0.05)，低濃度可以降低MDA含量，但差異不顯著;熒光染色結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞核破裂或固縮嚴(yán)重，細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)致密的藍(lán)色熒光顆粒，CIG三個(gè)濃度組可以改善損傷細(xì)胞的形態(tài)，維持細(xì)胞膜的完整性，核膜破裂減輕;流式檢測(cè)結(jié)果是，Control組細(xì)胞早期凋亡率與晚期凋亡率之和為0.59％，模型組細(xì)胞的總凋亡率為28.87％，兩組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，CIG高、中、低濃

8、度三組細(xì)胞凋亡率分別為11.09％、15.84％、22.20％，三組與模型組之前的差異，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有意義(P＜0.05)。CIG10-100μg/ml濃度，能顯著升高損傷后細(xì)胞T-AOC、SOD以及GSH-Px活性，三組數(shù)據(jù)與模型組的差異均具有顯著性意義(P＜0.05);熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，CIG高、中、低濃度組能夠顯著降低損傷后細(xì)胞內(nèi)的Ca2+含量;Western Blot結(jié)果顯示，CIG不同濃度組可以顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)