母親妊娠期間睡眠剝奪對子代行為的影響及其神經(jīng)炎癥途徑的研究.pdf

1、女性妊娠期間睡眠不足或睡眠異常是一個(gè)非常普遍的現(xiàn)象，有三分之二的婦女在妊娠期間出現(xiàn)睡眠問題，如睡眠時(shí)間縮短、睡眠質(zhì)量下降、覺醒次數(shù)增多等。盡管這種睡眠問題在孕期十分常見，但關(guān)于妊娠期間睡眠異常對子代健康的影響還缺乏足夠的關(guān)注。本研究試圖探索妊娠期間睡眠剝奪（MaternalSleepDeprivation,MSD）對子代遠(yuǎn)期的行為和認(rèn)知的影響及其可能的機(jī)制，主要研究內(nèi)容如下：
　　1.以多平臺法對不同孕期Wistar大鼠給予睡眠剝

2、奪，觀察其對母親生理指標(biāo)的影響。根據(jù)改良的多平臺方法建立Wistar大鼠睡眠剝奪模型，并確定孕鼠的這種睡眠剝奪方法是成功的，而且沒有出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象。分別在孕鼠妊娠的三個(gè)時(shí)期，即妊娠早期（GestationalDay4，GD4）、妊娠中期（GD9）和妊娠晚期（GD18）給予72小時(shí)的睡眠剝奪，檢測不同時(shí)期睡眠剝奪后孕鼠體重的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，孕鼠在各個(gè)妊娠階段體重都沒有顯著性差異，提示72小時(shí)睡眠剝奪對孕鼠的體重?zé)o顯著的影響。
　　

3、2.孕鼠分別在妊娠早、中和晚三個(gè)時(shí)期進(jìn)行睡眠剝奪，檢測對青春期前期21天大（Post-NatalDay21，PND21）的子代認(rèn)知、行為和神經(jīng)發(fā)生的影響。通過Morris水迷宮的方法來檢測子代海馬依賴的空間學(xué)習(xí)和記憶，免疫組織化學(xué)染色的方法研究海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生，并探索母親睡眠剝奪對子代出生時(shí)的體重、21天大時(shí)的體重、窩別大小、雌雄性別比和糖水偏好的影響。發(fā)現(xiàn)孕鼠妊娠晚期睡眠剝奪增加子代在場景學(xué)習(xí)和逆向?qū)W習(xí)任務(wù)中尋找平臺的時(shí)間，減少空間探索

4、任務(wù)中穿過平臺的次數(shù)和在平臺所在象限的時(shí)間，表明這一時(shí)期子代的空間學(xué)習(xí)和記憶的損傷更嚴(yán)重；BrdU和DCX陽性細(xì)胞的數(shù)量在晚期睡眠剝奪子代中減少最多，表示子代神經(jīng)發(fā)生也是在這一時(shí)期抑制更明顯，這表明孕鼠妊娠晚期對睡眠剝奪這種應(yīng)激更為敏感，所以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中都選擇這一時(shí)期。母親妊娠晚期睡眠剝奪會減少子代出生時(shí)的體重和PND21天大的體重，并減少子代窩別大小，引起子代出現(xiàn)快感缺乏，但是不影響子代雌雄性別比。
　　3.母親妊娠晚期睡眠剝

5、奪對子代小膠質(zhì)細(xì)胞和中樞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響。通過實(shí)時(shí)PCR的方法（Real-TimePCR,RT-PCR）檢測不同年齡段的子代（PND1、PND7、PND14和PND21）海馬區(qū)炎癥因子表達(dá)情況，以免疫組織化學(xué)染色鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和激活狀況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在母親妊娠晚期睡眠剝奪子代海馬中，促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNFα和IL-6在出生后的第1、7、14、21天表達(dá)增加，抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)在此時(shí)間點(diǎn)均降低；免疫組織化

6、學(xué)染色發(fā)現(xiàn)激活態(tài)和過渡態(tài)的Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著升高，靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而且這些促炎性細(xì)胞因子是由激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的。這些結(jié)果表明母親妊娠晚期睡眠剝奪誘導(dǎo)的子代海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的激活對子代認(rèn)知和神經(jīng)發(fā)生異常有很重要的調(diào)節(jié)作用。
　　4.探索抑制神經(jīng)炎癥對MSD子代認(rèn)知和神經(jīng)發(fā)生的保護(hù)效應(yīng)。選擇了一種小膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制劑-米諾環(huán)素，進(jìn)行連續(xù)五天腹腔注射來研究小膠質(zhì)細(xì)胞激活影響MSD子代認(rèn)知和神經(jīng)發(fā)育的具體機(jī)制

7、。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可以改善MSD子代空間學(xué)習(xí)與記憶的損傷，免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可以緩解MSD子代海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的減少，子代的神經(jīng)損傷可以通過米諾環(huán)素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活來恢復(fù)，從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用，表明小膠質(zhì)細(xì)胞是子代認(rèn)知和神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。
　　5.米諾環(huán)素改善MSD子代認(rèn)知和神經(jīng)發(fā)生的可能機(jī)制。小膠質(zhì)細(xì)胞激活有兩種型態(tài)：經(jīng)典激活（Classicalactivation,M1）和替代激活（Alte

8、rnativeactivation,M2），通過RT-PCR的方法、酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）和免疫組織化學(xué)方法檢測子代海馬中M1和M2分子的表達(dá)來確定小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)。在MSD子代海馬中，小膠質(zhì)細(xì)胞M1標(biāo)記：IL-1β,IL-6,TNF-α,CD68和iNOS的表達(dá)增多，而M2分子Arg1,Ym1,IL-4,IL-10和CD206的表達(dá)減少；當(dāng)注射了米諾環(huán)素以后，

9、可以減少促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，增加M2分子的表達(dá)，而且還可以改善與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)；這表明米諾環(huán)素表現(xiàn)出的神經(jīng)保護(hù)作用是通過抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞激活來實(shí)現(xiàn)的，因此小膠質(zhì)細(xì)胞促炎性和抗炎性激活之間的紊亂是MSD誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生異常和空間學(xué)習(xí)與記憶損傷的關(guān)鍵。
　　綜上所述，MSD子代的認(rèn)知、行為和神經(jīng)發(fā)生異常是通過小膠質(zhì)細(xì)胞激活誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥引起的，米諾環(huán)素可抑制MSD子代小膠質(zhì)細(xì)胞激活、調(diào)節(jié)M1和M