妊娠期孕鼠接觸SEB對(duì)子代成年大鼠T細(xì)胞的印跡效應(yīng)及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcal enterotoxin B，SEB）既是一種毒素性物質(zhì)，又是一種超抗原。SEB作為一種腸毒素少量進(jìn)入人體內(nèi)即可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，作為一種超抗原可以刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)中大量T細(xì)胞活化增殖。SEB進(jìn)入機(jī)體后，初期可激活 Vβ8+T細(xì)胞并誘發(fā)大量增殖，繼而過(guò)度增殖的細(xì)胞發(fā)生凋亡導(dǎo)致克隆清除，而出現(xiàn)中樞或外周耐受。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)妊娠期孕鼠接觸SEB導(dǎo)致子代新生鼠T細(xì)胞亞群比例的改變，

2、表明妊娠期孕鼠接觸SEB已在新生兒期對(duì)子代鼠細(xì)胞免疫產(chǎn)生影響，那么這種改變是否可保留至成年期形成印跡效應(yīng)，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們?cè)谇捌谘芯炕A(chǔ)上，研究妊娠期孕鼠接觸SEB對(duì)子代成年大鼠胸腺、脾臟和血液中CD4/CD8T細(xì)胞及 Vβ8.2 T細(xì)胞亞群的影響；研究妊娠期孕鼠接觸SEB對(duì)子代成年大鼠體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答的影響；研究子代成年大鼠細(xì)胞免疫對(duì)再次接受SEB刺激的免疫應(yīng)答反應(yīng)；研究子代成年大鼠外周血中IFN-γ及IL

3、-4的水平及脾臟淋巴細(xì)胞中IFN-γ及IL-4基因的甲基化水平。其研究結(jié)果將為妊娠期接觸SEB對(duì)子代細(xì)胞免疫的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為探討一些胎源性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴選用清潔級(jí)成年SD大鼠，交配及確定受孕后，孕鼠飼養(yǎng)至妊娠16天隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組（SEB組）孕鼠通過(guò)尾靜脈注射15μg SEB，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，給予等體積的PBS（磷酸鹽緩沖液），繼續(xù)飼養(yǎng)孕鼠至自然分娩，讓子代新生鼠生長(zhǎng)至成年時(shí)期，即獲得子代成年大鼠。⑵取子

4、代成年大鼠胸腺、脾臟及外周血，制備單細(xì)胞懸液，熒光抗體（CD3 FITC、CD8 PE、CD4 APC）染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4/CD8T細(xì)胞。⑶取子代成年大鼠的胸腺及外周血，制備單細(xì)胞懸液，熒光抗體（Vβ8. FITC、CD8 PE、CD3 APC）染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)Vβ8.2T細(xì)胞。⑷再次給予子代成年大鼠靜脈注射SEB，同時(shí)設(shè)立同窩子代大鼠注射SEB作為對(duì)照組，5天后獲取其胸腺、脾臟及外周血，分離其淋巴細(xì)胞，熒光抗體（CD3 F

5、ITC、CD8 PE、CD4 APC）染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4/CD8 T細(xì)胞。⑸再次給予子代成年大鼠靜脈注射SEB，同時(shí)設(shè)立同窩的子代大鼠作為對(duì)照組，5天后取其胸腺及外周血，分離其淋巴細(xì)胞，染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Vβ8.2 T細(xì)胞。⑹無(wú)菌條件下取出子代成年大鼠的脾臟，分離淋巴細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別給予ConA及SEB連續(xù)刺激3天，每天取出培養(yǎng)的細(xì)胞檢測(cè)其增殖指數(shù)及其T細(xì)胞亞群。⑺獲取子代成年大鼠的血漿，ELISA檢測(cè) IFN-γ及

6、IL-4的水平。⑻獲取子代成年大鼠的脾臟，通過(guò)MeDIP-qPCR檢測(cè)IL-4及IFN-γ基因的甲基化水平。
　　結(jié)果：①妊娠期接觸SEB對(duì)子代成年大鼠胸腺、脾臟及外周血中T細(xì)胞亞群的影響：SEB組子代成年雌雄性大鼠胸腺、脾臟及外周血中CD4+CD8?T細(xì)胞的比例較PBS組明顯增加，而CD4?CD8+T細(xì)胞的比例較PBS組明顯減少。②妊娠期接觸SEB對(duì)子代成年大鼠胸腺及外周血Vβ8.2T細(xì)胞的影響：妊娠期接觸SEB可明顯減少子代成

7、年雌雄性大鼠胸腺及外周血中Vβ8.2T細(xì)胞的比例。③妊娠期已接觸SEB的子代成年雌雄性大鼠，與同窩對(duì)照組比較，再次接觸SEB時(shí)可明顯減少胸腺中CD4+CD8?T細(xì)胞的比例，而增加CD4?CD8+T細(xì)胞的比例；在子代成年雌雄性大鼠脾臟及外周血中T細(xì)胞亞群表現(xiàn)出與胸腺中相類似的變化。3．再次注射SEB對(duì)妊娠期已接觸SEB的子代成年大鼠 Vβ8.2T細(xì)胞的影響。妊娠期已接觸SEB的子代成年雌雄性大鼠，再次注射SEB時(shí)對(duì)胸腺中Vβ8.2T細(xì)胞的

8、比例與對(duì)照組比較無(wú)差異，但外周血中Vβ8.2T細(xì)胞的比例卻較同窩對(duì)照組明顯增加。④實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著刺激時(shí)間增加體外培養(yǎng)的子代成年大鼠脾細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)，而且SEB組的子代成年雌雄性大鼠脾細(xì)胞接受SEB的刺激能力較ConA組弱；檢測(cè)T細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn)，給予SEB刺激時(shí)SEB組培養(yǎng)的脾細(xì)胞中CD4+CD8?T細(xì)胞的比例較ConA組減弱，但對(duì)CD4?CD8+T細(xì)胞的比例無(wú)明顯影響。⑤ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEB組子代成年大鼠外周血中IFN-γ及

9、IL-4的水平分別較PBS組明顯增加；在成年期再次給予SEB刺激后，其（PBS+SEB，SEB+SEB） IFN-γ及IL-4水平均較各自對(duì)照組（PBS+PBS，SEB+PBS）明顯減少。⑥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SEB組子代成年大鼠脾臟中 IFN-γ及 IL-4基因的甲基化水平均較PBS組明顯減少。
　　結(jié)論：⑴妊娠期接觸SEB改變了子代成年大鼠中樞及外周中CD4/CD8 T細(xì)胞及Vβ8.2T細(xì)胞的比例；⑵妊娠期接觸SEB改變子代成年大鼠CD4