富血小板纖維蛋白新生誘導(dǎo)骨的微觀結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能的研究.pdf

1、目的:通過(guò)建立beagle犬股骨髁的富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)骨誘導(dǎo)模型，對(duì)比觀察PRF、Bio-Oss、自體骨松質(zhì)三種不同骨替代材料的成骨效果，探討PRF誘導(dǎo)骨再生過(guò)程中新生骨的微觀結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能，綜合評(píng)價(jià)PRF修復(fù)骨缺損的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，為PRF在誘導(dǎo)骨再生及頜骨重建的臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型的建立
　　成年雄性beagle犬13只，隨機(jī)選擇

2、其中12只，每只經(jīng)腹腔麻醉后，采靜脈血9 ml×3支試管，離心10 min，速度為3000 r/m，取出試管中層的PRF，工具盒壓制成膜備用;選擇雙側(cè)后下肢股骨內(nèi)側(cè)髁，制備直徑6.0mm、深度10 mm的三個(gè)圓柱形骨缺損，根據(jù)各犬解剖結(jié)構(gòu)的條件盡可能分散排布，間隔大于3mm，標(biāo)記定位釘。用PRF膜、Bio-Oss骨替代材料及自體骨骨松質(zhì)隨機(jī)填入3處骨缺損，相應(yīng)大小的海奧生物膜覆蓋于Bio-Oss和自體骨充填的骨缺損表面，分層對(duì)位縫合關(guān)閉

3、創(chuàng)口。余下的一只實(shí)驗(yàn)犬，按相同方法切開(kāi)、顯露術(shù)區(qū)后，僅制備一處缺損，未填任何骨替代材料，作為空白對(duì)照。術(shù)后常規(guī)護(hù)理，根據(jù)所填材料不同，分為PRF組、Bio-Oss組和自體骨組，分別簡(jiǎn)稱(chēng)為P組、B組、Z組;根據(jù)取材時(shí)間的不同，將12只相同處理的beagle犬隨機(jī)分為2組為A組和B組，每組6只，編為A1～A6和B1～B6號(hào);空白對(duì)照的一只犬為C組。犬A組和C組術(shù)后觀察3個(gè)月、B組觀察6個(gè)月后取材（表1-1）。
　　表1-1 實(shí)驗(yàn)分組及

4、取材時(shí)間表
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　　┃組別\觀察時(shí)間\犬┃ A ┃ B ┃ C ┃
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　　┃ P組 ┃ 3個(gè)月 ┃ 6個(gè)月 ┃ / ┃
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　　┃B組 ┃ 3個(gè)月 ┃

5、6個(gè)月 ┃ / ┃
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　　┃Z組 ┃ 3個(gè)月 ┃ 6個(gè)月 ┃ / ┃
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　　┃空白對(duì)照組 ┃ / ┃ / ┃ 3個(gè)月 ┃
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　　2.大體觀察和X線檢查
　　

6、首先，A組、B組實(shí)驗(yàn)犬術(shù)后當(dāng)天、術(shù)后1個(gè)月行X線檢查。然后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在要求的時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，經(jīng)麻醉后空氣栓塞處死動(dòng)物，取雙側(cè)股骨髁，進(jìn)行大體觀察和拍攝X片。再將其用生理鹽水紗布包裹放入容器。X線檢查均采用相同的投照角度、距離、曝光時(shí)間。完畢后，將左側(cè)標(biāo)本儲(chǔ)存于-20℃冰箱中，右側(cè)浸泡于生理鹽水中，分別記為L(zhǎng)和R，備用。
　　3.Micro-CT測(cè)量分析
　　首先，打磨A、B組犬的右側(cè)股骨髁的外側(cè)面，使其平行于內(nèi)側(cè)面，將標(biāo)本

7、水平固定于樣本杯中，Micro-CT至上往下軸向掃描。掃描高度為15m，跨越790層，積分時(shí)間250ms，管電壓為70kVp，電流為114μA，層距為19μm，圖像矩陣2048像素×2048像素。采用軟件μ CT V6.1對(duì)圖像進(jìn)行重建分析，在新生骨區(qū)選取直徑3mm和高度1.5m的柱形區(qū)域，重復(fù)三次，三維高斯濾波(sigma1.2，support1)對(duì)圖像進(jìn)行降噪處理。然后，控制閾值范圍，PRF和自體骨松質(zhì)充填區(qū)域閾值為220～1000

8、，Bio-Oss區(qū)域中新生骨閾值為220～340，Bio-Oss顆粒閾值為341～1000。得到標(biāo)本的以下參數(shù):骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨小梁間距、各向異性程度和連接密度，由于移植材料不同，將分區(qū)域進(jìn)行Micro-CT的數(shù)據(jù)分析，因此分為P組、B組和Z組，之后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　4.植入扭矩的測(cè)定
　　打磨A、B組實(shí)驗(yàn)犬的右側(cè)股骨髁無(wú)新生骨一側(cè)即外側(cè)，至10mm高度。將標(biāo)本術(shù)區(qū)向上于臺(tái)虎鉗上固定，剝離多余的軟組

9、織，確定三處骨缺損的中心，逐級(jí)備洞，棘輪扳手植入DIO種植體φ3.8*10mm，以植體頂端平齊骨平面為準(zhǔn)，數(shù)顯扭矩扳手測(cè)量扭矩。整個(gè)過(guò)程均注意間歇預(yù)備和沖洗降溫，分別記錄P組、B組和Z組的手動(dòng)棘輪扳手和數(shù)顯扭矩扳手的扭矩值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　5.骨壓縮實(shí)驗(yàn)
　　由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和條件的限制，無(wú)法在取材后立即行骨壓縮實(shí)驗(yàn)，按生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)本的保存要求，我們已將前期取材的A、B組實(shí)驗(yàn)犬的左側(cè)股骨髁用生理鹽水紗布包裹，冷凍于-2

10、0℃冰箱里。實(shí)驗(yàn)前將其置于室溫下，自然復(fù)溫。固定標(biāo)本，在PRF、Bio-Oss和自體骨處理后形成的新生骨區(qū)域使用環(huán)形取骨鉆取出高度為10mm，直徑為5.5mm的圓柱形骨塊。按設(shè)計(jì)要求，用高速手機(jī)磨去多余骨組織，使兩端平行，得到經(jīng)游標(biāo)卡尺測(cè)量高度約為9mm的骨標(biāo)本，該過(guò)程注意間歇鉆取和沖洗降溫，分別記為P組、B組和Z組備用。采用萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)，儀器歸零后，在恒定室溫下，游標(biāo)卡尺測(cè)量?jī)赡＞唛g距即是準(zhǔn)確的骨高度并輸入系統(tǒng)，以1 mm/min的

11、加載速率軸向加壓，保持實(shí)驗(yàn)骨濕潤(rùn)，直至骨出現(xiàn)壓縮骨折，獲得新生骨的力學(xué)數(shù)據(jù)，繪制載荷—位移、應(yīng)力一應(yīng)變圖，計(jì)算得到每個(gè)標(biāo)本的剛度、強(qiáng)度、彈性模量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.13只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)順利完成，愈合良好，成功建立beagle犬股骨髁的PRF骨誘導(dǎo)模型。
　　2.大體觀察
　　P組、B組和Z組術(shù)后3個(gè)月時(shí):術(shù)區(qū)軟組織解剖層次不清，瘢痕明顯，關(guān)節(jié)囊內(nèi)有少許積液，見(jiàn)部分未降解的生物膜被結(jié)締組織包裹，固

12、定于原處。骨膜愈合良好，剝離骨膜，三組均見(jiàn)骨表面輕微凹陷，邊界欠清，未見(jiàn)Bio-Oss殘留顆粒。
　　P組、B組和Z組術(shù)后6個(gè)月時(shí):術(shù)區(qū)仍有瘢痕存在，關(guān)節(jié)囊內(nèi)積液有所減少，未見(jiàn)明顯的生物膜殘留。三組仍有骨凹陷存在，較3個(gè)月時(shí)凹陷變淺，邊界欠清。
　　空白對(duì)照組術(shù)后3個(gè)月時(shí):軟組織愈合無(wú)明顯異常，但骨缺損處凹陷明顯。
　　3.X線檢查
　　P組、B組和Z組術(shù)后當(dāng)天的X線影像顯示:與周?chē)９墙M織相比，P組密度顯著降

13、低;Z組密度略微降低;B組呈高密度影像;三者與周?chē)墙M織的界面清晰。
　　P組、B組和Z組術(shù)后1個(gè)月的X線影像顯示:較術(shù)后當(dāng)天影像，P組密度逐漸增高，低于周?chē)墙M織;Z組密度增高，接近周?chē)９墙M織;B組密度降低，但仍略高于周?chē)墙M織，范圍未見(jiàn)明顯縮小;三者與周?chē)墙M織之間的界面模糊。
　　P組、B組和Z組術(shù)后3個(gè)月的X線影像顯示:較術(shù)后1個(gè)月，P組密度進(jìn)一步增高，仍略微低于周?chē)墙M織，界面不清;Z組密度增高，近似周?chē)?，與

14、周?chē)墙M織無(wú)明顯界面;B組密度明顯降低，但依然高于周?chē)墙M織，高密度影像團(tuán)塊范圍向中心縮小，與周?chē)墙M織之間的界面可見(jiàn)一圈低密度影。
　　P組、B組和Z組術(shù)后6個(gè)月的X線影像顯示:較術(shù)后3個(gè)月，P組和Z組密度均接近周?chē)９墙M織，無(wú)明顯界面;B組高密度影像團(tuán)塊范圍進(jìn)一步向中心縮小，形狀不規(guī)則，其界面仍可見(jiàn)一圈縮窄的低密度影環(huán)繞，移行呈融合影。
　　空白對(duì)照組術(shù)后3個(gè)月的X線影像顯示:骨缺損見(jiàn)區(qū)明顯的圓形低密度影，由四周向中央

15、密度銳減，界面較清。
　　4.Micro-CT測(cè)量分析
　　斷層掃描圖像:3個(gè)月時(shí)，P組與Z組相似，均較周?chē)９墙M織密度稍低，清晰可見(jiàn)較規(guī)律排列的骨小梁，無(wú)明顯界面;然而，B組呈高密度影，界面較清。6個(gè)月時(shí)，三者界面均不清，P組和Z組骨小梁的量逐漸接近周?chē)墙M織，B組高密度影像范圍縮小。空白對(duì)照組3個(gè)月時(shí)，骨缺損區(qū)呈低密度影像，骨小梁極少，與周?chē)９墙M織有質(zhì)的區(qū)別，界面清晰。
　　三維重建圖像:天然骨區(qū)域骨小梁連續(xù)

16、，結(jié)構(gòu)清晰，排列有序，呈條或板狀。3個(gè)月時(shí)，P組新生骨骨小梁呈寬大的板狀，厚度較厚，但數(shù)量較少，連續(xù)性良好;Z組新生骨骨小梁的寬度、厚度、數(shù)量、密集程度均介于P組、B組之間，連續(xù)性良好·B組新生骨緊緊包繞Bio-Oss顆粒表面生長(zhǎng)，骨小梁呈條索狀，梁細(xì)、量多、緊密;空白對(duì)照組修復(fù)性骨再生失敗，無(wú)連續(xù)性骨小梁，骨痂呈點(diǎn)狀分布。6個(gè)月時(shí)，P組和Z組較3個(gè)月時(shí)，骨小梁數(shù)目、厚度稍有增多，排列更緊密;B組骨小梁反而略有變細(xì)，排列逐漸變稀疏，向正

17、常骨組織形態(tài)衍變。
　　B組的雙色界面圖，從3個(gè)月到6個(gè)月，紅色部分的Bio-Oss顆粒范圍向中心縮小，所占據(jù)的體積明顯減小，逐漸被新生骨取代，界面呈向心性移動(dòng)，成骨表現(xiàn)為向心性方式。P組界面圖，由于新骨與周?chē)菦](méi)有明顯的閾值區(qū)別，界面不明顯，但仍然可以看到隨時(shí)間的變化，骨小梁從中間向周?chē)饾u致密，同時(shí)中央空洞區(qū)域縮小和稀疏程度逐漸降低，密度逐漸增加。
　　全部指標(biāo)骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BV/

18、TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(trabecu lar number，Tb.N)、骨小梁間距(trabecular spacing，Tb.Sp)、各向異性程度(degree of anisotropy，DA)和連接密度(connectivity density，Conn.D)組間差異均有顯著性;兩兩比較得出全部指標(biāo)均為P組、Z組與B組的差異具有顯著性意義(P＜0.05)，P組和Z組

19、差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05);組內(nèi)兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁間距、連接密度反映出:P組和Z組的新生骨體積、數(shù)量、骨小梁分離度、連接密度均接近天然骨，但不如天然骨;相比天然骨，其主要差別表現(xiàn)為新生骨體積稍小，數(shù)量較少，空間排布略疏，連接密度較低。而B(niǎo)組的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然骨，表現(xiàn)為新生骨體積大、數(shù)量多，空間排布緊密，連接密度高。骨小梁厚度、各向異性程度反映出:P組和Z組新生骨

20、的骨小梁厚度及各向異性程度接近天然骨，骨成熟度良好;B組不如天然骨，新生骨的骨小梁:常細(xì)，各向異性程度也較低，骨成熟度差。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，三組新生骨的各項(xiàng)指標(biāo)有向天然骨衍變的趨勢(shì)。
　　5.植入扭矩的測(cè)定
　　36顆種植體均按要求成功植入P組、B組和Z組。
　　三組的數(shù)顯扭矩扳手和手動(dòng)棘輪扳手所測(cè)得的植入扭矩值，方差分析示組間差異均有顯著性意義。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月時(shí)，P組、Z組與B組的差異有顯著性意義(P＜0.05)，

21、P組與Z組的差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05);6個(gè)月時(shí)，P組、B組與Z組的差異有顯著性意義(P＜0.05)，P組與B組的差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。組內(nèi)兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　各組的特點(diǎn)和隨時(shí)間變化的情況:3個(gè)月時(shí)，P組和Z組的扭矩值接近，兩者小于B組;6個(gè)月時(shí)，P組的扭矩值小于Z組，與B組接近。P組和Z組扭矩值都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但B組則相反。
　　6.壓縮實(shí)驗(yàn)
　　完整取出P組

22、、B組和Z組的圓柱形新生骨標(biāo)本，共36塊，成功完成壓縮試驗(yàn)。
　　三組標(biāo)本的剛度、彈性模量和強(qiáng)度組間差異均無(wú)顯著性意義(P＞0.05)，組內(nèi)兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的差異無(wú)顯著性意義（P＞0.05）。但其均數(shù)顯示，3個(gè)月時(shí)P組較接近B組和Z組，6個(gè)月時(shí)P組和B組均不如Z組，并且隨愈合時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。
　　PRF新生誘導(dǎo)骨的生物力學(xué)性能，3個(gè)月時(shí)與Z組的新生骨相當(dāng)，6個(gè)月時(shí)雖不及Z組但與B組的新生骨相近。
　　結(jié)論:
　　1

23、.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備犬股骨髁的臨界性骨缺損，成功建立beagle犬股骨髁的PRF骨誘導(dǎo)模型。
　　2.實(shí)驗(yàn)制備的骨缺損，自身無(wú)法完成修復(fù)性骨再生，符合臨界性骨缺損的標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.PRF在修復(fù)骨缺損的過(guò)程中，X線影像和Micro-CT圖像均表現(xiàn)為向心性成骨方式。
　　4.PRF可誘導(dǎo)新生骨形成，其新生骨的微觀結(jié)構(gòu)與自體骨松質(zhì)組的新生骨相當(dāng)，相比Bio-Oss組的新生引導(dǎo)骨，它更接近生理狀態(tài)。3個(gè)月和6個(gè)月這兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，

24、PRF新生誘導(dǎo)骨的質(zhì)量的差異無(wú)顯著性意義，但各項(xiàng)指標(biāo)的均數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)向天然骨組靠近。
　　5.PRF組新生骨的植入扭矩隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，反映骨的質(zhì)量增高，與自體骨組相似，Bio-Oss組相反;6個(gè)月時(shí)，三組的新生骨均能為種植手術(shù)提供植入所需的扭矩條件，但縮短等待骨缺損修復(fù)的時(shí)間尚需慎重。
　　6.PRF誘導(dǎo)、Bio-Oss及自體骨引導(dǎo)形成的新生骨抗壓能力有隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大的趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性意義，因此尚不能認(rèn)為6個(gè)月