嗜酸性硫桿菌高效接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體及抗砷工程菌的構(gòu)建.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文嗜酸性硫桿菌高效接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體及抗砷工程菌的構(gòu)建姓名：蒙建州申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：劉相梅20090401山東大學(xué)碩十學(xué)位論文硫桿菌中穩(wěn)定存在的表達(dá)載體。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，初步測(cè)定了質(zhì)粒pMSD2Km和pJRD215在大腸桿菌和喜溫硫桿菌中的拷貝數(shù)。在大腸桿菌JMl09中，以大腸桿菌染色體組單拷貝基因D一1一脫氧木酮糖磷酸合成酶基因(D卜deoxyxylulose5phosphatesyn

2、thase，簡(jiǎn)稱dxs)為內(nèi)標(biāo)基因，以質(zhì)?？敲顾乜剐曰?yàn)閰⒈然颍辉谙矞亓驐U菌MTH04中，以喜溫硫桿菌染色體組基因核酮糖1，5一二磷酸羧化酶／力口氧酶(ribulose1，5biphosphatecarboxylase／oxygenase，簡(jiǎn)稱Rubisco)大亞基基因序列為內(nèi)標(biāo)基因，以質(zhì)粒的鏈霉素抗性基因?yàn)閰⒈然?。分別提取含有質(zhì)粒的菌株Ecoli(pMSD2Km)，Ecoli(pJRD215)，Acaldus(pMSD2一Km

3、)幣DAcaldus(pJRD215)的總DNA進(jìn)行適時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：質(zhì)粒pMSD2Km和pJRD215在大腸桿菌的拷貝數(shù)分別約為5“6拷貝(42％～63％)和15～17拷貝(47％“69％)，而在喜溫硫桿菌MTH04中的拷貝數(shù)分別約為5。6拷貝(30％～52％)和14～15拷貝(23％“45％)。在此基礎(chǔ)上以來(lái)自于大腸桿菌質(zhì)粒pUM3的抗砷基因?yàn)槟康幕?，?gòu)建重組質(zhì)粒pMSDlAs，pMSD2一As。以實(shí)驗(yàn)室原有基于質(zhì)

4、粒pJRD215構(gòu)建的抗砷質(zhì)粒pSDRAl為對(duì)照，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法，分別轉(zhuǎn)入喜溫硫桿菌MTH04，獲得抗砷基因工程菌株Acaldus(pMSD2As)，Acaldus(pMSDl一As)和Acaldus(pSDRAl)，進(jìn)一步檢測(cè)了各菌株在含有不同濃度亞砷酸鈉的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：對(duì)照工程菌Acaldus(pSDRAl)的最大耐受濃度為40mmol／L，新構(gòu)建工程菌Acaldus(pMSDlAs)的最大耐受濃度也為40mmo

5、l／L，但是菌體量低于工程菌Acaldus(pSDRAl)。而新構(gòu)建工程菌Acaldus(pMSD2一As)具有最強(qiáng)的抗砷能力，最大耐受濃度為45mmol／L。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了具有廣泛宿主范圍IncR族質(zhì)粒載體pMSDl和pMSD2，該系列質(zhì)粒具有接合轉(zhuǎn)移頻率高，分子量小，表達(dá)效率高及穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，為進(jìn)一步對(duì)硫細(xì)菌的遺傳改造奠定了基礎(chǔ)；運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，初步測(cè)定了質(zhì)粒pMSD2一Km和質(zhì)粒pJRD215在大腸桿菌和喜溫硫桿菌的