輔酶Q10對糖尿病大鼠牙周炎牙齦組織MMP-9和血清OPG、RANKL的影響.pdf

1、目的:建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，在此基礎(chǔ)上用輔酶Q10進(jìn)行干預(yù)，評價Ⅱ型糖尿病大鼠的牙周病損狀態(tài)的差異和變化，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測大鼠牙周組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases，MMP-9)的表達(dá)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測大鼠血清中骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivator for nuclear factor-κB

2、 ligand，RANKL)的水平的改變，探討輔酶Q10在阻斷或延緩糖尿病大鼠牙周炎發(fā)病進(jìn)程中的意義，為輔酶Q10臨床輔助治療或預(yù)防糖尿病牙周炎提供理論參考。
　　方法:選取120只健康雄性Wistar大鼠，體重約180g左右，隨機(jī)分6組，20只為一組，分別為空白組（O組）、牙周炎組（P組）、糖尿病組（DM組）、糖尿病牙周炎組（DMP組）、輔酶Q10糖尿病組(QDM組)、輔酶Q10糖尿病牙周炎組（QDMP組）。動物分籠飼養(yǎng)，自由攝

3、食、水。所有大鼠稱重，監(jiān)測尾靜脈血糖。
　　1建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型
　　DM、DMP、QDM、QDMP組大鼠飼以高脂高糖飼料4周，再按大鼠體重40mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin STZ)，建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型[1]。注射后1-2周檢測血糖，空腹血糖達(dá)到16.65mmol/L者定為糖尿病大鼠。
　　2灌注輔酶Q10溶液
　　QDM、QDMP組大鼠每日將10％水溶性輔酶Q10按9

4、mg/kg灌胃，其余組大鼠每日同劑量生理鹽水灌胃。灌注輔酶Q10約5周，開始準(zhǔn)備建立牙周炎，糖尿病大鼠牙周炎模型，QDM、QDMP組大鼠輔酶Q10灌注至實驗結(jié)束。
　　3建立大鼠牙周炎模型
　　對P組、DMP組、QDMP組通過絲線結(jié)扎+飲自身糞便水法復(fù)制大鼠牙周炎模型。在牙周炎造模過程中，觀察六組大鼠整個實驗過程活動狀態(tài)、飲食、尿量等情況的變化，并每兩日觀察大鼠的牙齦組織的顏色，腫脹情況，有無探診出血等。根據(jù)牙周指標(biāo)和X線片

5、對比P組、DMP組、QDMP組大鼠在牙周炎造模過程中牙周破壞的程度，并分別于給藥前（即糖尿病大鼠造模成功后）及給藥后5周、9周（即大鼠牙周結(jié)扎第4周）、11周（即大鼠牙周結(jié)扎第6周）、13周（即大鼠牙周結(jié)扎第8周）末進(jìn)行牙周袋平均深度(Mean depth of periodontal pocket)以及牙槽骨垂直骨吸收總量(Total attachment loss)檢測，而后對其進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。分別于糖尿病大鼠造模成功后、給藥后5周

6、、大鼠牙周結(jié)扎第4周、6周、8周末各組大鼠在指標(biāo)觀測及檢測結(jié)束后，動物給予過量麻醉，迅速開胸取血2-3ml，離心，3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，取血清。立即分離大鼠下頜第一磨牙的牙齦組織，固定于40g/L多聚甲醛液中。(1)進(jìn)行牙齦組織脫水，石蠟包埋，制切片，免疫組化染色，光鏡下觀察，對牙周組織MMP-9的表達(dá)進(jìn)行測定。(2) ELISA法檢測大鼠血清OPG、RANKL的水平。
　　結(jié)果:
　　1建立Ⅱ型糖尿病動物模型
　

7、　DM、DMP、QDM、QDMP組大鼠空腹血糖大于16.65mmol/L，達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。
　　各組大鼠血糖水平的對比:糖尿病造模后分別記錄6組大鼠糖尿病造模后，輔酶Q10給藥5周及結(jié)扎后4、6、8周大鼠血糖值。糖尿病組(DM組)、糖尿病牙周炎組（DMP組）、輔酶Q10糖尿病組（QDM組）、輔酶Q10糖尿病牙周炎組（QDMP組）血糖分別與O組（空白對照組）、P組（牙周炎組）比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2牙周結(jié)扎后對

8、各組大鼠進(jìn)行牙周狀況的評價
　　O、DM、QDM組在實驗中牙齦組織未出現(xiàn)明顯牙齦紅腫和探針出血，無牙周袋形成和牙槽骨吸收。P、DMP、QDMP組牙周結(jié)扎后:三組比較結(jié)扎后DMP組最先出現(xiàn)下頜第一磨牙牙齦紅腫且探診極易出血，并于結(jié)扎后第2周末DMP組大鼠陸續(xù)開始出現(xiàn)牙周袋，較QDMP組和P組提前，且牙周袋的深度較QDMP組增加快。
　　糖尿病造模后和輔Q10給藥5周末，各組大鼠之間平均牙周探診深度和牙槽骨垂直吸收總量對比均無統(tǒng)

9、計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)扎后4、6、8周末大鼠下頜第一磨牙牙周袋平均深度和牙槽骨垂直吸收總量:DMP組＞QDMP組＞P組。結(jié)扎后4周，DMP組、QDMP組分別于O、DM、QDM組測量結(jié)果對比有差異(P＜0.05)，其余組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。P組雖然探診深度和牙槽骨垂直吸收總量雖大于O、DM、QDM組，但P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)扎后6周，P組、DMP組、QDMP組分別與O、DM、QDM組比較差異顯著(P＜0.01

10、)，P組與DMP組測量結(jié)果對比有差異(P＜0.05)。結(jié)扎后8周，P組、DMP組、QDMP組分別于O、DM、QDM組對比差異顯著(P＜0.01)，P組與DMP組，DMP組與QDMP組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　3大鼠HE染色組織形態(tài)的觀察
　　O組、DM組、QDM組大鼠牙齦組織極少量炎細(xì)胞浸潤，膠原束排列有序。結(jié)扎后8周，P組大鼠牙齦上皮增生，固有層可見中度炎細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維束排列紊亂。DMP組大

11、鼠牙齦上皮明顯增生，固有層可見大量炎細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生及毛細(xì)血管增生，大部分膠原纖維斷裂崩解。QDMP組大鼠牙齦上皮增生，固有層可見炎細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生及毛細(xì)血管增生，部分膠原纖維裂解。
　　4大鼠牙齦組織MMP-9的表達(dá)
　　O組大鼠在整個實驗過程中牙齦組織表達(dá)MMP-9無明顯改變;糖尿病造模后和輔酶Q10給藥5周末，DM、DMP、QDM、QDMP組高于O、P組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)扎后4，6，8周

12、末， DMP、QDMP組分別與O、P、DM、QDM組相比有差異(P＜0.05)，DMP組與P組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，DMP組與QDMP組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5大鼠血清中OPG、RANKL的水平和RANKL/OPG的比值
　　糖尿病造模后5個時間點檢測OPG、RANKL在血清中表達(dá)DM、DMP、QDM、QDMP組與P、 O組相比有顯著差異(P＜0.01)。牙周炎結(jié)扎后OPG、RANKL在M組血清

13、中表達(dá)增強(qiáng)，高于O組，但M組與O組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。隨給藥時間延長，結(jié)扎后6，8周時，DMP、QDMP組OPG、RANKL在血清中表達(dá)差異顯著(P＜0.01)。
　　RANKL/OPG的比值在糖尿病大鼠造模成功后、給藥后5周、牙周結(jié)扎后4周、牙周結(jié)扎后6周、牙周結(jié)扎后8周時，O組、P組分別與DM組、DMP組、QDM組、QDMP組比較，差異顯著(P＜0.01)。且在牙周結(jié)扎后8周末DM組與QDM組，DMP組與QDM

14、P組比較均差異顯著(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1本實驗通過對大鼠腹腔注射低劑量STZ成功建立了Ⅱ型糖尿病大鼠模型。利用局部絲線結(jié)扎+飲自身糞便水法成功建立了糖尿病大鼠的牙周炎模型。
　　2本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠的牙周炎發(fā)病時間提前，牙周破壞程度加重，再次證實糖尿病對牙周炎的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
　　3實驗發(fā)現(xiàn)一定劑量的輔酶Q10的應(yīng)用可以減輕糖尿病牙周炎大鼠牙周組織的病理性損傷程度。
　　4輔酶Q10對糖