人多能干細(xì)胞分化而來(lái)的平滑肌前體細(xì)胞治療壓力性尿失禁大鼠的研究.pdf

1、壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）是指在咳嗽、噴嚏、大笑等腹壓增高時(shí)出現(xiàn)的不自主地尿液滲漏。SUI是女性最為常見(jiàn)的尿失禁類型，尤其是老年婦女。SUI癥狀經(jīng)常發(fā)生在日常活動(dòng)中，因此嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和社交活動(dòng)，亦帶來(lái)心理精神負(fù)擔(dān)。SUI發(fā)病機(jī)制尚不明確，但尿道固有括約肌功能不全（Intrinsic sphincter deficiency，ISD）是導(dǎo)致SUI的重要因素。ISD主要由于尿道括

2、約肌的平滑肌層或橫紋肌層或其支配神經(jīng)出現(xiàn)損傷引起。具有ISD的SUI患者通常有更嚴(yán)重的尿失禁癥狀，且對(duì)常規(guī)的治療反應(yīng)不佳。當(dāng)保守治療失敗后，必須進(jìn)行手術(shù)治療。目前首選的手術(shù)治療方式，如中段尿道懸吊術(shù)等，僅是增加對(duì)尿道的支持、固定作用，并不涉及對(duì)損傷或老化的尿道括約肌進(jìn)行組織重建。而這類手術(shù)的長(zhǎng)期成功率約為40-50％，有很大一部分患者會(huì)出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)的情況。手術(shù)的局限性及逐漸進(jìn)展的尿道括約肌平滑肌層老化衰退被認(rèn)為是導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)的原因。因此

3、，有效恢復(fù)受損的尿道括約肌是需要積極探索的重要治療方式。
　　干細(xì)胞因其具備自我更新和多向分化的潛能，可應(yīng)用于SUI患者的尿道括約肌再生，這引起了研究領(lǐng)域的極大興趣。目前，已有成體干細(xì)胞（肌肉來(lái)源、泌尿系來(lái)源、脂肪來(lái)源、骨髓來(lái)源等）在SUI動(dòng)物研究或臨床研究中表現(xiàn)出在排尿功能的恢復(fù)、組織學(xué)的改善方面有較好的效果。但是，這些成體干細(xì)胞的臨床應(yīng)用仍存在眾多問(wèn)題，如提取的自體干細(xì)胞數(shù)量有限、細(xì)胞擴(kuò)增準(zhǔn)備時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、移植細(xì)胞為多種細(xì)胞類型混

4、合、攜帶表觀遺傳改變等等。這些障礙不利于干細(xì)胞療效的優(yōu)化，也影響了我們對(duì)干細(xì)胞具體作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，為避免上述問(wèn)題，人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或許可以成為新的干細(xì)胞來(lái)源。另外，現(xiàn)階段的干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)主要修復(fù)的是尿道外括約肌（橫紋?。?，尚未有僅針對(duì)尿道內(nèi)括約肌（平滑?。┰偕难芯繄?bào)道。研究人員發(fā)現(xiàn)，在SUI研究中應(yīng)用最廣的成體間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)僅有一小部分能夠分化為平滑肌細(xì)胞，而由于成體間充質(zhì)干細(xì)胞移植混雜有多種細(xì)胞類型，分化而來(lái)

5、的平滑肌細(xì)胞是否對(duì)尿道括約肌功能重建有促進(jìn)作用及有關(guān)機(jī)制都無(wú)法明確。
　　目的:我們?cè)噲D探索人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stemcells，iPSCs)分化而來(lái)的單一平滑肌前體細(xì)胞(Progenitor smooth muscle cells，pSMCs)對(duì)重建SUI動(dòng)物模型尿道功能的作用及機(jī)制。首先，通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同SUI大鼠建模方式的建模效果進(jìn)行比較，以期找到更穩(wěn)定更適宜干細(xì)胞

6、移植研究的長(zhǎng)期SUI模型。在此基礎(chǔ)上，分化而來(lái)的pSMCs在移植入SUI大鼠尿道周圍一段時(shí)間后，根據(jù)LPP和尿道外周括約肌肌電圖（Electromyography，EMG）基線的測(cè)試，判斷尿道功能的恢復(fù)情況。根據(jù)尿道括約肌組織學(xué)檢查、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)主要組成彈性纖維和膠原纖維的蛋白比較、移植細(xì)胞體內(nèi)融合實(shí)驗(yàn)等分析平滑肌前體細(xì)胞恢復(fù)尿道功能的作用機(jī)制。
　　方法:1、根據(jù)終末觀察時(shí)間的不

7、同將150只產(chǎn)后SD大鼠隨機(jī)分為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn):1周短期觀察實(shí)驗(yàn)、4周和8周長(zhǎng)期觀察實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、尿道松解組、恥骨-尿道韌帶損傷（Pubo-urethral ligament injury，PULI）組和多次陰道球囊擴(kuò)張組(Multiple vaginal distention，MVD)。除對(duì)照組及1周短期實(shí)驗(yàn)中的尿道松解組和PULI組外，其余組均在手術(shù)的同時(shí)附加了雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)(Bilateral salp

8、ingo-oophorectomy，BSO)。1周短期觀察實(shí)驗(yàn)通過(guò)Crede法對(duì)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行漏尿點(diǎn)壓力(Leak point pressure，LPP)測(cè)試:術(shù)前、術(shù)后立即和術(shù)后一周。4周和8周長(zhǎng)期觀察實(shí)驗(yàn)通過(guò)Crede法和垂直-傾斜板(vertical tilt tabel，VT)法在術(shù)后4周和8周的終末時(shí)間點(diǎn)對(duì)LPP進(jìn)行測(cè)試。術(shù)后8周LPP測(cè)試后收集大鼠的尿道進(jìn)行組織學(xué)分析。2、108只成年未經(jīng)產(chǎn)的Rowett裸鼠隨機(jī)分為四組:對(duì)

9、照組（無(wú)干預(yù)）、生理鹽水組（手術(shù)+生理鹽水注射）、膀胱平滑肌細(xì)胞(Bladder smoothmuscle cells，BSMC)組（手術(shù)+人BSMC注射）、平滑肌前體細(xì)胞(pSMCs)處理組（手術(shù)+pSMCs注射，包括人胚胎干細(xì)胞H9、游離型載體介導(dǎo)重編程的iPSC（Episomal reprogrammed induced pluripotent stem cells，Epi-iPSC）、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)重編程的iPSC分化而來(lái)的pS

10、MCs）。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)得出的更好的SUI建模方式對(duì)Rowett nude(RNU)大鼠進(jìn)行手術(shù)。手術(shù)后3周，在尿道周圍注射分化好的平滑肌前體細(xì)胞（2×106個(gè)細(xì)胞/只）。注射5周后測(cè)試LPP和尿道外周括約肌EMG基線。3、對(duì)H9-pSMCs實(shí)驗(yàn)中的四組（正常對(duì)照組、生理鹽水組、BSMC組、H9-pSMCs組）的尿道組織，進(jìn)行平滑肌特異性蛋白、骨骼肌肌動(dòng)蛋白雙重免疫熒光染色，評(píng)價(jià)尿道括約肌肌層的變化;進(jìn)行彈性纖維、膠原蛋白雙重染色，評(píng)

11、價(jià)尿道ECM結(jié)構(gòu)的變化;RT-qPCR檢測(cè)大鼠尿道組織中的人彈性蛋白、人ERV-3，判斷H9-pSMC是否在大鼠體內(nèi)大量增殖及分化;Western Blot比較四組大鼠尿道組織中的彈性蛋白、膠原蛋白Ⅲ含量，對(duì)組織學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;在5只SCID小鼠單側(cè)后肢長(zhǎng)收肌注射熒光素標(biāo)記的1×106H9-pSMCs，進(jìn)行體內(nèi)生物信號(hào)BLI追蹤，并對(duì)注射部位的組織進(jìn)行切片染色檢測(cè)pSMCs移植后的融合情況。
　　結(jié)果:1、在1周觀察實(shí)驗(yàn)中，尿道松

12、解組術(shù)后立即（33.69±2.27 cmH2O）和術(shù)后1周時(shí)的LPP（39.34±2.08 cmH2O）與術(shù)前（50.40±1.99 cmH2O）(p＜0.05)相比顯著降低。MVD+BSO組的術(shù)后一周LPP(35.17±1.76 cmH2O)與術(shù)前(49.39±4.44 cmH2O)(p＜0.05)相比也有同樣的結(jié)果;在4周觀察實(shí)驗(yàn)中，各組與對(duì)照組相比均沒(méi)有顯著差異;而在術(shù)后8周時(shí)，僅有尿道松解組經(jīng)VT法測(cè)得的的LPP與對(duì)照組相比顯著

13、降低(28.26±1.11 vs38.89±3.91 cmH2O)(P＜0.05)，其余組LPP均無(wú)差異。組織學(xué)結(jié)果也證實(shí)術(shù)后8周時(shí)，尿道松解組尿道中的彈力纖維和膠原纖維破壞得最為嚴(yán)重。2、iPSC分化而來(lái)的平滑肌前體細(xì)胞處理組，不論是游離型載體方法重編程的iPSC(N=9，mean=19.4±1.33 cm H2O)，還是逆轉(zhuǎn)錄病毒方法重編程的iPSC(N=8，mean=18.45±1.41 cm H2O)，與生理鹽水組(N=14，m

14、ean=14.16±1.07 cm H2O)(p＜0.05)相比，LPP顯著升高，與尿道功能恢復(fù)相一致。而H9分化的平滑肌細(xì)胞處理組的LPP(N=22，mean=16.66±0.74 cm H2O)與生理鹽水組(N=10，mean=15.52±1.09 cm H2O)的差異并不顯著，但仍然顯示出了其LPP向正常對(duì)照組的LPP水平(N=13，mean=18.75±0.96cm H2O)靠攏的發(fā)展趨勢(shì)。3、尿道組織學(xué)顯示H9-pSMCs處理

15、的大鼠尿道與生理鹽水組相比具有更豐富的彈性纖維和更厚的肌層。Western blot結(jié)果證實(shí)H9-pSMCs處理組的大鼠尿道和膀胱中的彈性蛋白、膠原蛋白含量顯著增加。人彈性蛋白的基因表達(dá)在大鼠尿道組織中未檢測(cè)到，說(shuō)明細(xì)胞外基質(zhì)的合成是來(lái)源于大鼠自身組織，而不是移植的人類細(xì)胞。嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠的體內(nèi)pSMCs生物信號(hào)追蹤和免疫熒光染色結(jié)果證明pSMCs可以長(zhǎng)

16、期存活，并融合入SCID小鼠組織且表達(dá)平滑肌細(xì)胞表型。
　　結(jié)論:尿道松解術(shù)方法建立的SUI大鼠模型較為穩(wěn)定，更適宜干細(xì)胞移植研究;人多能干細(xì)胞（hESC和iPSC）分化而來(lái)的平滑肌前體細(xì)胞可以恢復(fù)括約肌功能，這一發(fā)現(xiàn)為多能干細(xì)胞分化大量平滑肌細(xì)胞用于泌尿系統(tǒng)的功能恢復(fù)提供了可能性;H9-pSMC的尿道周移植能夠促進(jìn)大鼠受損尿道的結(jié)構(gòu)重建，其作用機(jī)制包括通過(guò)旁分泌調(diào)節(jié)ECM代謝、刺激自身括約肌修復(fù)、pSMC可能增殖并整合入再生的括

17、約肌肌層。本研究首次揭示人多能干細(xì)胞(H9hESC、iPSCs、Epi-iPSCs)來(lái)源的pSMCs能夠恢復(fù)SUI大鼠的尿道功能。iPSCs來(lái)自自體細(xì)胞，能夠減少宿主免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)也避免了hESCs應(yīng)用的倫理問(wèn)題。本研究使用的iPSCs有兩種誘導(dǎo)方式，一種是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒，這種方式可以使病毒顆粒整合到宿主基因組中，導(dǎo)致基因突變，因而不能應(yīng)用于臨床，另一種是通過(guò)非整合方式誘導(dǎo)完成的Epi-iPSCs，對(duì)人體相對(duì)無(wú)害。因此，Epi-iP