毛細(xì)管電泳在線富集技術(shù)在生物樣品分析中的應(yīng)用.pdf

1、生物樣品一般是指生物組織、細(xì)胞、體液、體內(nèi)代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)及生物標(biāo)志物等。生物樣品復(fù)雜多樣，微量待測物質(zhì)存在于大量介質(zhì)中，并且介質(zhì)中存在大量干擾物質(zhì)，給樣品分析帶來極大困難。生物樣品的特點(diǎn)是被測物質(zhì)樣品量少，濃度低，容易失活，基質(zhì)復(fù)雜等。常規(guī)分析中的樣品數(shù)目一般較多。因此，建立一種簡單快速、靈敏度高、樣品消耗少的生物樣品分析方法勢在必行。
　　毛細(xì)管電泳具有高效快速、設(shè)備簡單、試劑消耗量少的特點(diǎn)，成為當(dāng)前分離分析科學(xué)中活躍的研究

2、領(lǐng)域之一，在生物樣品分析中有其它方法無可比擬的優(yōu)勢。但因其進(jìn)樣量少導(dǎo)致檢測靈敏度低，從而限制了其在痕量物質(zhì)檢測中的廣泛應(yīng)用。為了提高方法的檢測靈敏度，使毛細(xì)管電泳技術(shù)能夠適用于分析更多復(fù)雜樣品中的痕量組分，發(fā)展了樣品在線富集技術(shù)。在線富集技術(shù)無需增加其它儀器，富集是在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的，具有靈敏度高、成本低廉、操作簡單、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，近年來越來越受分析領(lǐng)域研究者的青睞。
　　本論文在前人工作的基礎(chǔ)上，研究了毛細(xì)管電泳富集法在生物樣

3、品分析中的應(yīng)用，主要開展了如下具有創(chuàng)新性的工作:
　　1.根據(jù)氨基酸的兩性性質(zhì)和弱酸堿性，聯(lián)用動(dòng)態(tài)pH聯(lián)接和掃集富集技術(shù)，并采用紫外間接檢測法，建立了微量酸性氨基酸的含量測定新方法，探討了新方法的適用性，測定了復(fù)合氨基酸注射液和人血清中酸性氨基酸的含量。
　　2.利用環(huán)糊精形成包合物的性質(zhì)，在樣品基質(zhì)中加入γ-環(huán)糊精以增強(qiáng)待測組分與膠束的親和性，從而增強(qiáng)掃集效果，同時(shí)將場強(qiáng)放大技術(shù)與掃集技術(shù)結(jié)合，建立了測定生物樣品中痕量恩諾

4、沙星和環(huán)丙沙星的毛細(xì)管電泳分析新方法，并探討了其在六種動(dòng)物源性食品（牛奶、奶粉、雞肉、豬肉、豬肝、豬腎）中的應(yīng)用。
　　根據(jù)內(nèi)容，本論文共分為四章。
　　第一章:簡述了生物樣品的特點(diǎn)、生物樣品的分析方法及前處理方法。綜述了毛細(xì)管電泳常用的富集方法的原理，各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以及在生物樣品分析中的應(yīng)用。
　　第二章:選擇苯甲酸作為紫外探針，建立了一種靈敏度高、簡單快速的檢測復(fù)雜基質(zhì)中痕量酸性氨基酸—谷氨酸和天冬氨酸的定量分析

5、方法，并對體系的性能進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。新方法聯(lián)用了動(dòng)態(tài)pH聯(lián)接和掃集技術(shù)，以β-環(huán)糊精為絡(luò)合劑進(jìn)行掃集。采用總長度為50 cm、有效長度為42 cm的未涂層的石英毛細(xì)管作為富集和分離毛細(xì)管。緩沖體系由10mM三羥甲基氨基甲烷、8mM苯甲酸和10 mMβ-環(huán)糊精組成(pH7.5)。樣品基質(zhì)為3mM的磷酸(pH2.5)。該方法富集作用強(qiáng)大，大大提高了檢測靈敏度。與常規(guī)方法相比，該法對谷氨酸和天冬氨酸的靈敏度分別提高30倍和55倍，檢測限分別

6、為0.061μg/mL和0.032μg/mL。線性范圍均為0.1-8.0μg/mL，峰面積與濃度間的線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。為了進(jìn)一步增大血清中天冬氨酸與干擾雜質(zhì)峰的分離度，在樣品基質(zhì)中加入6％(v/v)的甲醇，靈敏度略有降低，對谷氨酸和天冬氨酸的檢測限分別為0.125μg/mL和0.057μg/mL。該法成功測定了去蛋白后的人血清樣品中的谷氨酸和天冬氨酸的含量，回收率分別為82％和87％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9％和

7、2.0％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)pH聯(lián)接-掃集與間接紫外結(jié)合的方法是測定谷氨酸和天冬氨酸含量的簡單快速的在線富集方法。該法無需繁瑣的衍生化步驟，將分析時(shí)間縮短至10 min以內(nèi)，也不需要像質(zhì)譜檢測器那樣昂貴的檢測器，適用于常規(guī)生物樣品分析。
　　第三章:本章分為兩部分。
　　第一部分，采用總長度為65 cm、有效長度為57 cm的未涂層的石英毛細(xì)管作為富集和分離毛細(xì)管，建立了同時(shí)測定微量恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量的毛細(xì)管電泳富集新方

8、法，并對體系作了方法學(xué)驗(yàn)證。該技術(shù)是將場強(qiáng)放大富集技術(shù)與掃集富集技術(shù)結(jié)合起來建立的。為了增強(qiáng)待測組分與膠束的親和性，以增強(qiáng)掃集富集效果，在樣品基質(zhì)中加入了γ-環(huán)糊精。背景緩沖液由20 mM三羥甲基氨基甲烷和80 mM脫氧膽酸鈉組成，pH為8.8。樣品基質(zhì)由300 mM三羥甲基氨基甲烷和5mMγ-環(huán)糊精組成，pH為10.0。進(jìn)樣時(shí)間為300 s，電壓為15 kV，檢測波長為270 nm。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，與常規(guī)進(jìn)樣分析（樣品基質(zhì)為背景緩沖

9、液，進(jìn)樣時(shí)間為5s）相比，新方法對恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測靈敏度分別提高了374倍和406倍，檢測限分別為1.87 ng/mL和2.21 ng/mL。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的峰面積與濃度之間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.9998和0.9999。新方法重復(fù)性高，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.46％和2.40％，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.46％和2.95％。
　　第二部分，為了使新建的方法適于測定具有

10、復(fù)雜基質(zhì)的生物樣品中的微量恩諾沙星和環(huán)丙沙星，對進(jìn)樣時(shí)間和脫氧膽酸鈉濃度做了調(diào)整，即背景緩沖液由20 mM三羥甲基氨基甲烷和120mM脫氧膽酸鈉組成，pH為8.8。進(jìn)樣時(shí)間為240 s。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，與常規(guī)進(jìn)樣分析(樣品基質(zhì)為背景緩沖液，進(jìn)樣時(shí)間為5s)相比，新方法對恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測靈敏度分別提高了124倍和122倍，檢測限分別為5.70 ng/mL和7.39 ng/mL。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的峰面積與濃度之間線性相關(guān)系數(shù)(r

11、)分別為0.9994和0.9997。新方法重復(fù)性高，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.99％和2.40％，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.44％和2.14％。該方法成功應(yīng)用于牛奶、奶粉、雞肉、豬肉、豬肝和豬腎等生物樣品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測，回收率在85％-102％之間，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.1％-4.4％之間。新方法的檢測限遠(yuǎn)低于有關(guān)部門規(guī)定的恩諾沙星和環(huán)丙沙星在動(dòng)物源性食品中的最大殘留量，并且所用試劑價(jià)廉易得，

12、樣品前處理簡單，可用于常規(guī)檢測動(dòng)物源性食品中的藥物殘留。
　　第四章:總結(jié)了本論文的主要結(jié)論和展望。
　　本論文研究結(jié)果表明，毛細(xì)管電泳在線富集方法是有效且經(jīng)濟(jì)的提高毛細(xì)管電泳檢測靈敏度的方法。它不僅操作簡單、成本低廉，而且在不延長分析時(shí)間的同時(shí)可使檢測靈敏度顯著提高。在用于生物樣品分析時(shí)，對樣品前處理要求無高效液相色譜嚴(yán)格，可大大縮短分析時(shí)間。將毛細(xì)管電泳在線富集法用于分析生物樣品中的微量成分，對于擴(kuò)展毛細(xì)管電泳在微量物質(zhì)