金黃色葡萄球菌非蛋白成分PGN模擬肽保護(hù)性作用機(jī)制研究及LTA模擬肽初步篩選和鑒定.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 金黃色葡萄球菌非蛋白成分PGN模擬肽保護(hù)性作用機(jī)制研究
　　一、PGN模擬肽合成與體外鑒定
　　1.線性肽SP27特異性結(jié)合抗PGN單抗根據(jù)前期工作，選擇含保守序列“xH”的No.27號(hào)陽(yáng)性噬菌體克隆(SPHxHSRLRSES)合成線性肽SP27(Biotin-(SA)SPHxHSRLRSES(GG))和SP27b(Biotin-SPHxHSRLRSES(SAGG)),SA、G

2、G、SAGG為兩側(cè)發(fā)揮支架作用的氨基酸殘基，ELISA結(jié)果顯示:SP27和SP27b均呈劑量依賴性特異性結(jié)合抗PGN單抗，且不與抗LTA單抗反應(yīng)，提示核心序列SPHxHSRLRSES模擬PGN表位。
　　2.四分枝多價(jià)抗原肽MAP27特異結(jié)合抗PGN單抗及抗S.aureus多抗基于SP27序列，以多聚賴氨酸為支架合成四分枝多價(jià)抗原肽MAP27，ELISA結(jié)果顯示:MAP27不僅能夠特異性結(jié)合抗PGN單抗(MAP27 vs MAP(

3、ctrl)，P=0.02; MAP27 vs PBS，P=0.021)也能特異性結(jié)合抗金葡菌多克隆抗體(MAP27vs MAP(ctrl)，P=0.002; MAP27 vs PBS，P=0.002)，提示MAP27維持原始線性肽SP27抗原性，模擬PGN抗原表位。
　　3.MAP27模擬PGN表位刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子100μg/ml MAP27體外刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞6h，收取上清，ELISA結(jié)果顯示MAP27

4、可刺激腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-6(MAP27 vs MAP(ctrl)，P=0.045; MAP27vs blank,P=0.018)、IL-1β(MAP27 vs MAP(ctrl), P=0.002; MAP27 vs blank,P=0.000)，提示該合成肽在一定程度上模擬了PGN的生物學(xué)活性。
　　二、PGN模擬肽MAP27主動(dòng)免疫保護(hù)作用
　　1.免疫方法4-6周，雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組，分別以MAP27

5、和MAP(ctrl)加弗氏佐劑進(jìn)行免疫，兩次免疫間隔2周，共進(jìn)行5次，第三組小鼠同期飼養(yǎng)但未進(jìn)行合成肽免疫，作為空白對(duì)照。合成肽末次免疫后第七天，以2×107CFU/只滅活菌加強(qiáng)免疫三組小鼠（包括空白組）一次。
　　2.MAP27免疫誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生低效價(jià)抗金葡菌抗體和抗PGN抗體每次免疫后一周檢測(cè)血清效價(jià)。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，MAP27免疫組在免疫三次后即產(chǎn)生抗MAP27的IgG類抗體，效價(jià)達(dá)到1∶104，并可維持10周。滅

6、活金葡菌加強(qiáng)免疫后，MAP27免疫組小鼠產(chǎn)生抗金葡菌超聲裂解產(chǎn)物(MAP27 vsMAP(ctrl), P=0.000; MAP27 vs blank,P=0.000）及抗PGN(MAP27 vs MAP(ctrl),P=0.026; MAP27 vs blank，P=0.015)的IgG類抗體，但效價(jià)僅在1∶200倍。
　　3.在補(bǔ)體存在下，兔抗MAP27抗血清體外殺菌/抑菌作用以MAP27作為免疫原免疫新西蘭兔獲得抗血清，實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果顯示，在補(bǔ)體存在下兔抗MAP27抗血清產(chǎn)生對(duì)甲氧西林敏感株(MSSA，ATCC25923)較強(qiáng)的殺菌/抑制作用（MAP27免疫血清vs正常兔血清，P=0.000）。
　　4.MAP27免疫誘導(dǎo)小鼠抵御金葡菌系統(tǒng)性感染末次滅活菌加強(qiáng)免疫各組小鼠，5天后以致死劑量5×108CFU MSSA攻擊(iv)，觀察各組死亡率。MAP27免疫組小鼠7天內(nèi)生存率為50％，空白對(duì)照組和MAP(ctrl)組小鼠分別在感染后第2天和第5天全部死亡(

8、MAP27 vs MAP(ctrl)，P=0.000;MAP27 vs blank， P=0000);尾靜脈注射亞致死劑量2×107CFU MSSA(ATCC25923)，感染3天后取各組小鼠腎臟、肺臟，研磨后檢測(cè)臟器中細(xì)菌殘存量，結(jié)果顯示MAP27免疫組小鼠腎臟、肺臟中細(xì)菌載量顯著低于對(duì)照組(MAP27 vs MAP(ctrl)，Pkidney=0.029, MAP27 vs blank, Pkidney=0.029;MAP27 vs

9、 MAP(ctrl), Plung=0.016,MAP27 vs blank，Plung=0.008)。提示MAP27免疫誘導(dǎo)小鼠抵御金葡菌系統(tǒng)性感染。
　　三、PGN模擬肽MAP27誘導(dǎo)保護(hù)性作用機(jī)制的研究
　　1.MAP27免疫組小鼠在感染早期臟器中IFN-γ、IL-17A/F和CCL3含量顯著增高末次以滅活金葡菌加強(qiáng)免疫各組小鼠，尾靜脈感染3天后取各組小鼠臟器，研磨后進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)，ELISA結(jié)果顯示:與MAP(ct

10、rl)組和空白對(duì)照組相比，MAP27免疫鼠脾臟、肺臟、肝臟IFN-γ(MAP27 vs MAP(ctrl)和IL-17A/F(MAP27 vs MAP(ctrl)水平明顯升高;同時(shí)可有效激活巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的趨化因子CCL3含量也明顯增多，提示MAP27免疫可能通過激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮保護(hù)作用。
　　2.MAP27免疫組小鼠在感染早期脾臟中IFN-γ+CD3+T細(xì)胞和IL-17+CD4+T細(xì)胞比例增高金葡菌感染3天后流式檢測(cè)

11、各免疫鼠脾臟胞內(nèi)IFN-γ、IL-17A表達(dá)，提示感染早期誘導(dǎo)MAP27免疫鼠體內(nèi)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)表明，MAP27刺激免疫鼠脾細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子末次滅活菌加強(qiáng)免疫一次后第5天，分別取各組小鼠脾細(xì)胞，體外培養(yǎng)中以100μg/mlMAP27刺激各免疫組小鼠脾細(xì)胞24h，ELISA檢測(cè)上清中細(xì)胞因子含量。結(jié)果表明MAP27免疫鼠脾細(xì)胞上清中IL-2、IFN-γ含量顯著高于對(duì)照肽免疫組及空白對(duì)照組小鼠;未檢測(cè)到IL

12、-17A/F。ELISPOT結(jié)果顯示低劑量MAP27及抗小鼠CD28抗體刺激MA27免疫鼠生成IFN-γ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spot-forming cells，SFCs)顯著多于MAP(ctrl)免疫組和空白組(MAP27 vs MAP(ctrl)，P=0.001; MAP27 vs blank，P=0.001)，提示合成肽體外刺激可能誘導(dǎo)免疫鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)表明，滅活菌刺激MAP27免疫鼠脾

13、細(xì)胞分泌Th1和Th17細(xì)胞因子天然抗原滅活菌體外刺激各免疫鼠脾細(xì)胞72h， ELISA結(jié)果示MAP27免疫鼠脾細(xì)胞上清中IL-2、IFN-γ和IL-17A/F含量顯著高于對(duì)照肽免疫組和空白對(duì)照組，提示MAP27免疫組小鼠脾細(xì)胞可識(shí)別天然抗原并分泌Th1/Th17型細(xì)胞因子。
　　第二部分 LTA模擬肽篩選與鑒定
　　一、應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選金葡菌LTA模擬肽克隆
　　1.噬菌體肽庫(kù)篩選以抗LTA單抗為釣餌蛋白，分別

14、采用固相法和液相法對(duì)噬菌體12線性肽庫(kù)進(jìn)行三輪篩選。固相法篩選富集率僅44倍，而液相篩選富集率可達(dá)300倍。從固相法所得第三輪洗脫產(chǎn)物中隨機(jī)挑選65個(gè)噬菌體克隆，雙夾心ELISA鑒定后得到18個(gè)與抗LTA單抗結(jié)合的陽(yáng)性克隆;從液相法第三輪洗脫產(chǎn)物中隨機(jī)挑選45個(gè)噬菌體克隆，夾心ELISA鑒定后僅得到4個(gè)與抗LTA單抗特異性結(jié)合的克隆。相較于固相篩選，液相篩選所得陽(yáng)性克隆無非特異吸板序列。
　　2.陽(yáng)性噬菌體測(cè)序及序列分析將固相法所

15、得18個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，共得到9個(gè)不同的序列。
　　二、模擬肽的合成及抗原性鑒定
　　選擇含保守序列Hx或xx的陽(yáng)性噬菌體克隆合成線性肽L3-1(HSVHxDFRQxxQPS(GGGS))和L2((HS)GHxDFRQxxQPS(GGGS))，HS、GGGS為起支架作用氨基酸殘基，ELISA結(jié)果顯示L3-1和L2均能以濃度梯度依賴方式和抗LTA單抗結(jié)合，且L3-1反應(yīng)優(yōu)于L2，故根據(jù)L3-1序列