丹參酮ⅡA磺酸鈉誘導乳兔BMSCs向軟骨細胞分化中的作用及細胞密度對誘導的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 乳兔BMSCs和軟骨細胞提取、生物學性質(zhì)觀察及丹參酮ⅡA磺酸鈉對兩種細胞體外擴增的影響
　　背景：骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)功能是造血和細胞功能支持，該細胞的數(shù)量是隨著年齡增大而降低的;呈典型的長梭形，漩渦狀生長，具有很強的分化潛能;軟骨細胞(Chondrocyte)是軟骨組織的唯一細胞種類。軟骨細胞生成和維持軟骨基質(zhì)（主要包括膠原和蛋白聚糖）。針對人類軟骨損傷修復，仍然亟

2、待解決，其生長單層性質(zhì)和環(huán)境要求導致不能單純擴增解決修復。細胞組織工程應用在這方面逐漸廣泛。
　　目的：分離乳兔骨髓間充質(zhì)干細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞并傳代培養(yǎng)、利用多種檢測方法觀察其生物學性狀。研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳兔BMSCs和軟骨細胞的體外擴增的作用;驗證其對兩種細胞的體外擴增作用及尋找出均促進兩種細胞增長進行進一步實驗的最佳藥物濃度。
　　方法：選用全骨髓貼壁分離法進行乳兔骨髓間充質(zhì)細胞的分離;二步酶消化法乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨取

3、材獲取軟骨細胞。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生物學形狀和相關(guān)檢測進行鑒定;等比稀釋法配制15種不同濃度的丹參酮ⅡA磺酸鈉溶液，分別單獨培養(yǎng)乳兔BMSCs和軟骨細胞以及兩種細胞以1∶1比例混合細胞群，繪制細胞生長曲線;探索最佳藥物濃度。
　　結(jié)果：乳兔BMSCs和軟骨細胞形態(tài)觀察分別長梭形和短梭形，相關(guān)檢測均鑒定為目的細胞，且丹參酮ⅡA磺酸鈉培養(yǎng)1∶1比例混合細胞時呈現(xiàn)增長，最佳濃度是50ug/ml，而單獨細胞培養(yǎng)時在區(qū)間37.5u

4、g/ml至62.5ug/ml，因此50ug/ml作為進一步實驗研究的最佳培養(yǎng)濃度。
　　結(jié)論：乳兔BMSCs和軟骨細胞提取選擇全骨髓貼壁法和二步酶消化法可行;丹參酮ⅡA磺酸鈉最佳實驗濃度應為50ug/ml。
　　第二部分 丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳兔BMSCs向軟骨細胞誘導轉(zhuǎn)化作用的研究
　　目的：研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳兔BMSCs向軟骨細胞誘導轉(zhuǎn)化作用。
　　方法：設(shè)立只更換培養(yǎng)基的正常乳兔BMSCs陰性對照組、最

5、佳丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度的誘導實驗組和加TGF-β1軟骨誘導體系的陽性對照組;12孔板作培養(yǎng)板，孔底置爬片，誘導7天、14天、21天后分別取出爬片進行番紅O染色、甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色、FDA/PI熒光等檢測和利用RT-PCR定量檢測蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達量，驗證丹參酮ⅡA磺酸鈉在乳兔乳兔BMSCs向軟骨細胞誘導轉(zhuǎn)化作用的大小。
　　結(jié)果：陰性對照組的乳兔BMSCs未發(fā)生性狀的明顯改變，各種檢測均未呈陽性表現(xiàn);實驗

6、組和TGF-β1軟骨誘導體系組均發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)變化，逐漸由長梭形變?yōu)槎趟笮位蚨噙呅?，各種檢測均為陽性表現(xiàn)，且在誘導過程中，時間越長，乳兔骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為軟骨細胞量最多，但TGF-β1軟骨誘導體系組明顯多于實驗組，RT-PCR檢測顯示在實驗組和TGF-β1軟骨誘導體系組均有蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白表達，實驗組低于TGF-β1軟骨誘導體系組。
　　結(jié)論:丹參酮ⅡA磺酸鈉能促進乳兔BMSCs向軟骨細胞誘導轉(zhuǎn)化。
　　第三部分 細

7、胞種板密度對誘導轉(zhuǎn)化作用影響的研究
　　目的：研究細胞種板密度對誘導轉(zhuǎn)化作用影響。
　　方法：分別對12孔板種不同密度的乳兔BMSCs，分為三組，低密度組，中密度組和高密度組;均使用TGF-β1軟骨誘導體系進行誘導轉(zhuǎn)化實驗，定期更換培養(yǎng)液，誘導14天后進行細胞形態(tài)觀察、Ⅱ型膠原免疫組化染色、FDA/PI熒光顯影和RT-PCR等檢測，驗證細胞密度對誘導轉(zhuǎn)化過程的影響。
　　結(jié)果：三組誘導14天后均有明顯的間充質(zhì)細胞形態(tài)變