無(wú)義突變的F9和MEN1基因的翻譯調(diào)控及基因通讀研究.pdf

1、由于遺傳或者是獲得性的原因，在基因正常終止密碼子的上游產(chǎn)生了一個(gè)終止密碼子，稱(chēng)為早發(fā)性無(wú)義突變（PTC）。大約有三分之一的人類(lèi)疾病是由于早發(fā)性無(wú)義突變引發(fā)的，其中主要包括遺傳性疾病和癌癥類(lèi)疾病，本文主要針對(duì)的兩種疾?。貉巡是一種X染色體連鎖的隱性遺傳性疾病，是由編碼凝血因子IX基因（F9）突變導(dǎo)致的先天性凝血機(jī)制障礙疾病，根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，早發(fā)性無(wú)義突變占F9基因突變中的11.1％；多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病I型（MEN1）是一種常染色

2、體顯性遺傳癌癥類(lèi)疾病，作為抑癌基因的MEN1，其上80%的突變是無(wú)義突變或是移碼突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　早發(fā)性無(wú)義突變引發(fā)的疾病在傳統(tǒng)的治療上以替代療法、手術(shù)、放療和化療為主，翻譯通讀治療（TBT）在近年來(lái)逐步成為治療早發(fā)性無(wú)義突變疾病的主要策略之一，翻譯通讀治療以促通讀藥物作用于早發(fā)性無(wú)義突變位點(diǎn)，使帶有PTC的基因發(fā)生通讀效應(yīng)，表達(dá)出全長(zhǎng)的具有功能的蛋白。
　　氨基糖苷類(lèi)藥物（G418等）和非氨基糖苷類(lèi)藥物（PTC1

3、24等），作為促通讀藥物，在 PTC引發(fā)疾病的治療中具有一定的療效，但是不同患者的療效差異很大，影響通讀效率的因素有很多：促通讀藥物的選擇、PTC所在基因位置的上下文結(jié)構(gòu)以及無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解途徑（NMD），這些影響因素的檢測(cè)和考量是個(gè)體化治療的前提和基礎(chǔ)。另外，大量促通讀候選藥物亦需要高通量的篩選體系來(lái)完成篩選過(guò)程。
　　首先，本研究針對(duì)促通讀藥物的研究需求，利用綠色熒光蛋白（EGFP）基因和紅色熒光蛋白（DsRed）基

4、因構(gòu)建早發(fā)性無(wú)義突變雙熒光篩選體系，該體系包括雙熒光哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 pDsRed-EGFPmtag-及其早發(fā)性無(wú)義突變體pDsRed-EGFPmtag-Y445X，該體系轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS7后，載體能夠進(jìn)行正確的表達(dá)，并且能被流式細(xì)胞儀檢出。轉(zhuǎn)染早發(fā)性無(wú)義突變體 pDsRed-EGFP mtag-Y445X的細(xì)胞經(jīng)促通讀藥物PTC124處理，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光蛋白的平均熒光強(qiáng)度，可以精確得出促通讀藥物的通讀效率，而且發(fā)現(xiàn)PTC

5、124的促通讀效果與作用濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，隨后實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)目標(biāo)基因EGFP的mRNA的定量檢測(cè)，同樣證實(shí)了PTC124具有劑量依賴(lài)性的促通讀活性。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明該篩選體系克服了現(xiàn)行熒光素酶表達(dá)體系熒光素底物假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確的反映藥物促通讀活性。
　　該載體采用雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)，以DsRed紅色熒光作為內(nèi)標(biāo)，排除了共轉(zhuǎn)染等操作步驟帶來(lái)的系統(tǒng)誤差，可以精確計(jì)算PTC的通讀效率；該載體預(yù)留的多克隆位點(diǎn)，

6、可以插入帶有PTC及其上下文結(jié)構(gòu)的基因片段，最大程度的模仿促通讀藥物作用的細(xì)胞環(huán)境，對(duì)通讀藥物的效果做出精確的測(cè)量。
　　其次，本研究以遺傳性疾病血友病B的F9基因?yàn)檠芯繉?duì)象，將F9基因的編碼序列導(dǎo)入雙熒光哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 pDsRed-EGFPmtag-，構(gòu)建了表達(dá)載體pDsRed-F9-EGFPmtag-，并根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫(kù)中登記的點(diǎn)突變構(gòu)建了該載體的3個(gè)無(wú)義突變體Y22X、E258X和E296X。突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞COS7后，氨

7、基糖苷類(lèi)藥物G418和非氨基糖苷類(lèi)藥物PTC124分別處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PTC124的促通讀效果要優(yōu)于G418，利用凝血因子IX促凝活性檢測(cè)試劑盒測(cè)試部分支持上述結(jié)果。
　　再次，本研究以癌癥類(lèi)疾病多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病I型的MEN1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，在本小組的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)構(gòu)建MEN1基因的小基因，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，促通讀藥物作用后，MEN1基因由于其上的PTC而受到NMD途徑調(diào)控，促通讀藥物PTC12

8、4能提高menin全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)量，但是得到的menin全長(zhǎng)蛋白功能恢復(fù)情況得不到確切的反映。本研究以干擾質(zhì)粒pSIR-MEN1-10轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，干擾MEN1表達(dá)， qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MEN1的效應(yīng)基因Caspase8伴隨MEN1的敲減而下調(diào)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)減緩了細(xì)胞的凋亡，為PTC124的促通讀效果給出了功能水平上的直接證據(jù)。
　　最后，本研究擴(kuò)展了無(wú)義突變促通讀藥物雙熒光篩選體系的應(yīng)用范圍：構(gòu)建了帶有雙標(biāo)簽（HA t

9、ag和c-Myc tag）的凝血因子IX小基因II（Mini-hF9-II gene），該小基因由三部分組成：外顯子1-7+內(nèi)含子7＋外顯子8。構(gòu)建了含有Mini-hF9-II基因的重組表達(dá)質(zhì)粒 pCMV-3B-Mini-hF9-II，并將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過(guò) RT-PCR及Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，小基因可以正確剪切、拼接和表達(dá)全長(zhǎng)蛋白。導(dǎo)入篩選體系后，將能從EJC模型的角度考查NMD途徑對(duì)促通讀藥物的影響；本文分離并通過(guò)細(xì)胞

10、形態(tài)學(xué)、表面抗原以及多向分化能力等方法鑒定了間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），并且將雙熒光篩選體系初步轉(zhuǎn)染了間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強(qiáng)的分化潛能，外源基因易于植入間充質(zhì)干細(xì)胞，并且植入的基因易于在間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的表達(dá)而不影響其特性，對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞而言，植入外源基因引發(fā)的損傷小，反應(yīng)弱，將此雙熒光篩選體系和間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合起來(lái)，為構(gòu)建促通讀藥物篩選的間充質(zhì)干細(xì)胞模型，更為下一步促通讀藥物篩選的動(dòng)物模型體內(nèi)