梗阻性淤膽中MRP2轉錄后下調及獐牙菜苦苷保護作用研究.pdf

1、研究背景:
　　膽汁酸轉運蛋白對于維持BA(bile acids)的腸肝循環(huán)有重要作用。遺傳和獲得性BA轉運蛋白缺陷涉及例如膽汁淤積、膽結石、脂肪肝、肝癌等多種肝膽管疾病。人BSEP(ABCB11)突變是至少3種臨床上肝疾病的分子機制，BRIC2(良性復發(fā)性肝內膽汁淤積Ⅱ型)、PFIC2(進行性家族遺傳性肝內膽汁淤積Ⅱ型)、ICP（妊娠期肝內膽汁淤積）。MRP2突變會引起DJS（Dubin-Johnson綜合征）。核受體通過感受細

2、胞內BAs的濃度緊密調節(jié)BA轉運蛋白來維持BA平衡。除了核受體的調節(jié)外，轉錄后調控也起重要的作用。轉錄后調控可以通過插入和撤回細胞膜的轉運蛋白發(fā)揮作用。與轉錄調控一起，轉錄后調控調節(jié)細胞膜轉運蛋白的表達和活性。
　　泛素化是一個可逆的翻譯后修飾，最近的研究表明Ub(Ubquitin)修飾在更寬的領域和在細胞過程中有更多的功能。Kensuke Aida等人發(fā)現(xiàn)表達在肝細胞小管膜側的ABC轉運蛋白，如膽鹽輸出泵(BSEP)和多耐藥相關

3、蛋白2（MRP2）通過泛素化降解，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)在梗阻性膽汁淤積中，這MRP2轉運蛋白在總蛋白水平也有所下降。所以我們猜想，在梗阻性膽汁淤積中，小管膜MRP2通過內吞后，最后的歸宿是經過泛素化至蛋白酶體降解。
　　獐牙菜苦苷是從川西獐牙菜屬提煉出來治療黃疸的中國傳統(tǒng)中藥。UDCA和它的類似物能阻止炎癥和增加毒性膽汁酸的消除。是目前在臨床上廣泛用來治療膽汁淤積病人如PBC（原發(fā)性膽汁性肝硬化）的藥物。然而1/3-2/3的PBC病

4、人對UDCA沒有很好的反應。INT747是FXR的激動劑，目前是二期臨床研究藥物，在模型中通過改變膽汁酸的代謝發(fā)揮抗膽汁淤積的作用。因此，尋找靶定炎癥和膽汁酸池的藥物治療膽汁淤積有重要的臨床意義。
　　研究方法:
　　1.我們收集了30例臨床梗阻性膽汁淤積肝臟樣品和14例正常對照肝臟樣品，所有取到的樣品立即切成小塊裝在凍存管內放入液氮罐保存，用時取出適量組織。
　　2.人梗阻性膽汁淤積和正常對照肝臟樣品中泛素連接酶(G

5、P78，HRD1，TEB4)、膽管膜轉運蛋白（MRP2）、核受體(RXRα) mRNA表達水平通過實時定量PCR檢測。
　　3.人梗阻性膽汁淤積和正常對照肝臟樣品中泛素連接酶(GP78，HRD1，TEB4))、膽管膜轉運蛋白（MRP2）、核受體(RXRα)蛋白表達水平通過實時Western-Blot檢測。
　　4.MRP2和Ubiquitin之間的蛋白間相互作用通過免疫共沉淀檢測
　　5.通過穩(wěn)定轉染GP78shRNA

6、敲減HepG2細胞中GP78表達，驗證是否GP78在MRP2的降解中發(fā)揮重要作用。
　　6.將所有大鼠隨機分成3組（每組7只）:假結扎生理鹽水組，BDL生理鹽水組，BDL獐牙菜苦苷組。BDL獐牙菜苦苷組第一次預灌一天獐牙菜苦苷(100mg/(kg/d)，溶解于1％Tween-20)，第二天行BDL手術，繼續(xù)灌胃至3d，7d，14d。
　　7.血清樣品ALT, AST, ALP, TBA，TBIL，DBIL用試劑盒通過酶標法檢

7、測
　　8.取樣品時，假結扎生理鹽水組，BDL生理鹽水組，BDL獐牙菜苦苷組血清凍于-80℃，用時冰上解凍。通過ELISA試劑盒檢測三組大鼠中血清細胞因子(TNFα，IL-1β，IL-6)水平。
　　9.通過試劑盒檢測三組大鼠血清中CDCA，TCDCA，CA，TCA，DCA，TDCA，TUDCA,α/βMCA,αMCA,βMCA, Tgh, TG, HDL-C, LDL-C的濃度。
　　10.大鼠肝臟樣品固定在4％多聚

8、甲醛中，固定一周后石蠟包埋切片，標準流程做HE染色。
　　實驗結果:
　　1.實時定量PCR證實:在梗阻性膽汁淤積肝臟樣品中GP78 mRNA表達量是正常對照肝臟樣品的2.1倍(P＜0.05)，而且其他兩個泛素連接酶(HRD1，TEB4)則無明顯變化。
　　2.Western-Blot顯示:在梗阻性膽汁淤積肝臟樣品中GP78蛋白表達量是正常對照肝臟樣品的4.2倍(P＜0.05)，而且其他兩個泛素連接酶(HRD1，TEB

9、4)則無明顯變化。
　　3.提取梗阻性膽汁淤積肝臟樣品和正常對照肝臟樣品總蛋白，做免疫共沉淀實驗，證實梗阻性膽汁淤積肝臟中MRP2的泛素化明顯增加。
　　4.用ubquition-eGFP和ubquition-koeGFP質粒瞬時轉染HEK293細胞，24h時后收取細胞總蛋白，然后做免疫共沉淀實驗。結果表明，在轉染ubquition-eGFP HEK293細胞中MRP2的泛素化降解明顯增加。
　　5.用GP78shRN

10、A質粒篩選穩(wěn)定轉染的HepG2細胞，提取細胞株RNA和總蛋白，real-time PCR結果顯示，GP78敲減后，MRP2 mRNA表達量增加1.5倍(P＜0.05)，而RXRαmRNA表達量無明顯變化。Western-Blot檢測顯示GP78敲減后，MRP2蛋白表達量和RXRα蛋白表達量均增加(P＜0.05)。
　　6.14d時BDL灌獐牙菜苦苷組比BDL生理鹽水組血清ALT，AST水平明顯下降(P＜0.05)
　　7.B

11、DL獐牙菜苦苷組在3d，7d時，血清TNFα含量明顯降低，分別是BDL生理鹽水組的63％和64％(P＜0.05)。BDL獐牙菜苦苷組在3d，14d時血清IL-1β水平分別是BDL生理鹽水組的43％和42％(P＜0.05)。BDL獐牙菜苦苷組在14d時血清IL-6水平是BDL生理鹽水組的61％(P＜0.05)。
　　8.BDL獐牙菜苦苷組與BDL生理鹽水組相比，血清中CDCA濃度在7d，14d時降低，TCDCA濃度在7d明顯降低(P

12、＜0.05)。血清CA水平在3d，7d，14d時降低(P＜0.05)。血清TCA濃度在3d，14d后明顯降低(P＜0.05)。血清TDCA水平在7d明顯下降(P＜0.05)。血清TUDCA水平在14d明顯下降(P＜0.05)。血清αMCA水平在3d，7d，14d時明顯降低(P＜0.05)，而βMCA水平在14d時明顯降低(P＜0.05)。
　　實驗結論:
　　1.人梗阻性膽汁淤積肝臟樣品中GP78 mRNA表達水平比正常對照

13、肝臟樣品中表達量明顯增加。
　　2.人梗阻性膽汁淤積肝臟樣品中GP78蛋白表達水平比正常對照肝臟樣品中表達量明顯增加。
　　3.人梗阻性膽汁淤積肝臟樣品中MRP2泛素化較正常對照肝臟樣品中明顯增加。
　　4.用GP78shRNA敲減HepG2細胞中，GP78、MRP2 mRNA和蛋白表達水平明顯增加。然而，RXRα僅蛋白水平表達增加，mRNA表達水平無明顯變化。
　　5.獐牙菜苦苷能減輕BDL大鼠肝損傷。