人阻塞性膽汁淤積肝臟適應(yīng)反應(yīng)及MRP2轉(zhuǎn)錄后下調(diào)的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　膽汁淤積(cholestasis)是多種疾病和生理狀態(tài)所致的常見(jiàn)臨床綜合癥，其病因包括如:（病毒性和非病毒性）肝炎(hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)、脂肪肝(fattyliver)、感染(infection)、膽道阻塞(bile duct obstruction)、遺傳病(genetic diseases)、孕娠(pregnant)等[1-4]。在膽汁淤積狀態(tài)下，肝細(xì)胞內(nèi)不斷積聚的毒

2、性膽汁酸(toxicbile acids)造成肝臟損傷，激發(fā)肝臟產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)(Adaptive responsive)，即膽汁酸代謝基因表達(dá)發(fā)生適應(yīng)性改變:(1)Phase0（攝入）相Ntcp、Oatps等表達(dá)下降，減少膽汁酸向肝細(xì)胞內(nèi)泵入;(2)PhaseⅠ（合成）相Cyp7a1、Cyp8b1等膽汁酸合成相關(guān)的酶類(lèi)表達(dá)下調(diào)，減少肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的生成;(3)PhaseⅡ(解毒)相Ugts、Sults、Gsts等膽汁酸硫酸化、葡萄糖苷化

3、、谷胱甘肽化有關(guān)的酶表達(dá)增強(qiáng)，從而增加膽汁酸的水溶性、降低膽汁酸的毒性;(4)PhaseⅢ(排泌)相的膽酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp3、Mrp4、Ostα/β的表達(dá)顯著上調(diào)，增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的排泌，減少毒性膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)的積聚[1-11]。然而，目前對(duì)于膽汁淤積適應(yīng)性反應(yīng)的分子機(jī)制的認(rèn)知，主要來(lái)源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外細(xì)胞培養(yǎng)。由于活體動(dòng)物、體外細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境均與人體存在顯著差異。因此，對(duì)于阻塞性膽汁淤積下肝臟是否產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)以及其具體的分子機(jī)

4、制尚不清楚。
　　尤其值得注意的是膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2/ABCC2，其定位表達(dá)于肝細(xì)胞膽管面膜，主要排泌結(jié)合膽紅素、膽汁酸等有機(jī)陰離子化合物[1，2，12]。但是，MRP2單基因缺失或突變會(huì)導(dǎo)致以高膽紅素血癥和膽汁酸增高為主要癥狀的Dubin-Jonhson綜合征[13]。因此，MRP2在膽汁淤積發(fā)生、發(fā)展中功能極其重要。近期文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠肝臟Mrp2 mRNA和總蛋白水平表達(dá)無(wú)明顯變化，而肝細(xì)胞膽管面膜Mrp

5、2表達(dá)顯著減少[14-17]。前期研究也表明，阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2 mRNA表達(dá)也無(wú)明顯變化[7，10]。因此，我們推測(cè)阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2蛋白表達(dá)減少可能為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，細(xì)胞骨架蛋白R(shí)adixin基因缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞膽管面膜Mrp2表達(dá)缺失，從而引起高膽紅素血癥[18]。有細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究表明，Radixin和Ezrin基因敲減可顯著減少人腸上皮細(xì)胞株Caco2細(xì)胞膜上的MRP2蛋白的表達(dá)[19,

6、20]。此外，Ezrin Thr567磷酸化與大鼠腸道上皮細(xì)胞頂膜MRP2蛋白定位表達(dá)密切相關(guān)，而且PKCα具有決定其表達(dá)定位的作用[21，22]。并且，膽汁淤積動(dòng)物模型肝臟PKC被活化，能夠在不影響肝臟MRP2 mRNA表達(dá)的情況下而減少肝細(xì)胞膜上MRP2蛋白的表達(dá)[15，23，24]。最新研究表明，蛋白激酶C(PKC)可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的Ezrin Thr567磷酸化[24]。因此，我們提出人阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2轉(zhuǎn)

7、錄后調(diào)控的分子機(jī)制假設(shè):阻塞性膽汁淤積時(shí)，肝臟蛋白激酶PKC被活化，誘導(dǎo)骨架蛋白Ezrin Thr567磷酸化，促使肝細(xì)胞膽管面膜MRP2內(nèi)吞，最后經(jīng)由蛋白酶體降解途徑(ERAD)降解。
　　在本研究中，我們收集人阻塞性膽汁淤積組和正常對(duì)照組病人肝臟組織，運(yùn)用Realtime qPCR(SYBR)、Westem-blot、免疫共沉淀、免疫熒光、免疫組化、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株等技術(shù)，闡明人阻塞性膽汁淤積肝臟的適應(yīng)性反應(yīng)以及驗(yàn)證MRP2轉(zhuǎn)錄

8、后下調(diào)的分子機(jī)制假設(shè)。
　　方法:
　　1.收集人阻塞性膽汁淤積組和正常對(duì)照組肝臟組織，一部分用4％多聚甲醛固定;一部分剪成小塊后，凍存于液氮罐保存，用于總RNA、總蛋白、總膜蛋白、核蛋白等提取。
　　2.Real time qPCR(SYBR)檢測(cè)阻塞性膽汁淤積組、對(duì)照組肝臟膽汁酸合成酶(CYP7B1、CYP8B1、CYP27A1)、肝臟解毒酶(UGT2B4/7、SULT2A1、GSTA1-4、GSTA1-5)、肝細(xì)

9、胞基底側(cè)膜膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OSTα/β、OCT1)、肝細(xì)胞膽管面膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCG2、ABCG5/8)以及調(diào)節(jié)相關(guān)核受體(VDR、PPARα、HNF1α、HNF4α、RXRα、RARα、LXR、FXR、SHP)和核轉(zhuǎn)錄因子(HNF3β、NRF2、AHR)的mRNA水平的表達(dá)情況。
　　3.Western-blot檢測(cè)上述基因在阻塞性膽汁淤積組和正常對(duì)照組的蛋白表達(dá)水平。
　　4.免疫熒光檢測(cè)膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OSTα/β、OCT1

10、、ABCG2、ABCG8和核受體VDR、HNF4α、RARα、FXR在阻塞性膽汁淤積組和正常對(duì)照組的蛋白表達(dá)定位情況。
　　5.Real time qPCR(SYBR)檢測(cè)阻塞性膽汁淤積組、對(duì)照組肝臟骨架蛋白(Ezrin、Radixin)、蛋白激酶C(PKCα、PKCδ、PKCε)、泛素連接酶E3s(gp78、TEB4、HRD1)的mRNA水平的表達(dá)情況。
　　6.Western-blot檢測(cè)上述基因在阻塞性膽汁淤積組、對(duì)照

11、組的蛋白表達(dá)情況。同時(shí)還檢測(cè)，Ezrin Thr567磷酸水平的情況。
　　7.免疫熒光和免疫組化檢測(cè)MRP2、Ezrin、磷酸化Ezrin Thr567在阻塞性膽汁淤積組、對(duì)照組肝臟表達(dá)定位情況。
　　8.通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)，研究Ezrin(磷酸化Ezrin Thr567)、Radixin、PKCα、PKCδ、PKCε、MRP2泛素化之間的相互作用。
　　9.構(gòu)建Ezrin野生型及突變體、PKCα野生型及突變體等He

12、pG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后，通過(guò)Real time qPCR、Western-blot等檢測(cè)其mRNA、總蛋白、總的膜蛋白和生物素標(biāo)記的膜蛋白的MRP2表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.阻塞性膽汁淤積下膽汁酸合成經(jīng)典途徑(CYP7A1)被抑制;而替代途徑(CYP7B1、CYP8B1)被激活。
　　2.阻塞性膽汁淤積下肝臟解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1-4、GSTM1-4蛋白表達(dá)顯著減少。
　　3.阻塞性膽

13、汁淤積下肝細(xì)胞基底側(cè)膜OSTβ、OCT1表達(dá)顯著增高、OSTα蛋白表達(dá)明顯減少;膽管面膜ABCG2、ABCG8表達(dá)顯著減少。
　　4.阻塞性膽汁淤積下肝臟核受體FXR表達(dá)顯著減少;VDR、RARα、HNF4α表達(dá)顯著增加。
　　5.阻塞性膽汁淤積下核受體FXR表達(dá)顯著減少，與肝臟解毒酶UGT2B、SULT2A1、GSTA1的表達(dá)減少存在顯著正相關(guān)。
　　6.阻塞性膽汁淤積下肝細(xì)胞膽管面膜MRP2表達(dá)顯著減少;總蛋白MR

14、P2表達(dá)也明顯減少。
　　7.阻塞性膽汁淤積下肝細(xì)胞骨架蛋白R(shí)adixin和Ezrin表達(dá)無(wú)明顯變化。但是，EzrinThr567磷酸化水平在膽汁淤積肝臟顯著增高，其脫磷酸化可影響Ezrin與MRP2蛋白間的相互作用。在HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株水平，Ezrin Thr567磷酸化可明顯減少肝細(xì)胞膜MRP2的表達(dá)。
　　8.阻塞性膽汁淤積下PKC在mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著增加。而通過(guò)肝臟組織樣品和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證明，PKCα

15、可誘導(dǎo)Ezrin Thr567磷酸化，同時(shí)減少肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞膜上MRP2的表達(dá)。
　　9.阻塞性膽汁淤積下泛素連接酶E3 gp78表達(dá)和MRP2泛素化明顯增加。在HepG2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，gp78干擾后可增強(qiáng)總蛋白MRP2的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)本研究表明，阻塞性膽汁淤積時(shí)，肝臟產(chǎn)生自我保護(hù)、適應(yīng)性反應(yīng)，一方面激活膽汁酸替代途徑（如CYP7B1、CYP8B1增高），另一方面增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸排泌（如OST

16、β增高），減輕肝臟損傷。但是，由于肝臟解毒酶（如UGT2B、SULT2A1、GSTA1）的表達(dá)顯著降低，從而消弱了適應(yīng)性反應(yīng)的效果。我們通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，阻塞性膽汁淤積下肝臟核受體FXR的減少與肝臟解毒酶表達(dá)(如UGT2B、SULT2A1、GSTA1)降低存在顯著正相關(guān)。這提示，F(xiàn)XR在阻塞性膽汁淤積下肝臟解毒功能消弱發(fā)揮重要的作用。而且，這也能很好的解釋?zhuān)現(xiàn)XR激動(dòng)劑(如UDCA、INT747)為何具有減輕膽汁淤積病人肝損傷的效果。

17、>　　此外，我們通過(guò)研究還發(fā)現(xiàn)，阻塞性膽汁淤積下肝臟MRP2表達(dá)下調(diào)為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其可能的分子機(jī)制:首先，蛋白激酶PKC(PKCα、PKCδ、PKCε)表達(dá)增高和激活;其次，PKC誘導(dǎo)EzrinThr567發(fā)生磷酸化，從而增強(qiáng)Ezrin與肝細(xì)胞膽管面膜MRP2的蛋白間相互作用;然后，磷酸化的Ezrin Thr567促使細(xì)胞膽管面膜MRP2內(nèi)吞;最后，內(nèi)吞至肝細(xì)胞內(nèi)的MRP2蛋白經(jīng)由泛素連接酶E3gp78介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑降解。理解和