膽汁淤積時白介素18對MRP2的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：膽汁淤積是臨床常見的綜合征，是指膽汁的合成、排泄過程發(fā)生障礙，導(dǎo)致膽汁成分在肝細(xì)胞中堆積，進(jìn)一步導(dǎo)致血液中膽汁成分的含量升高。肝臟是膽汁酸、膽紅素等合成、分泌、排泄及其再循環(huán)的重要器官。膽汁酸代謝要維持平衡，主要依賴于膽汁酸的攝取和排泄實現(xiàn)相對平衡;為了完成這種生理需要，肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了一套精細(xì)的膽汁酸攝取和排泄系統(tǒng)，由一系列分布于基底膜或小管側(cè)膜上的功能不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成，如有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic anion tran

2、sporter polypeptides，OATPs），膽鹽輸出泵(bilesalt export pump，BSEP)，鈉離子-牛磺膽汁酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodium/taurocholatecotransporting polypeptide，NTCP），多耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associatedproteins，MRPs)等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分布于肝細(xì)胞膜的不同部位，它們互相協(xié)調(diào)，分工合作，對膽汁的形成

3、、維持膽汁酸正常代謝、平衡，實現(xiàn)其生理功能并抵御膽汁酸毒性損傷起到重要的生理作用。目前認(rèn)為，膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異常改變可能是膽汁淤積發(fā)生、發(fā)展的重要分子機(jī)制。
　　多耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）是具有ATP結(jié)合域的盒式跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)子蛋白超家族(ATPbinding cassette transporter proteins superfamily)中C亞族成員，它主要位于肝細(xì)胞膜表面，此外在腎臟、大腸、小腸等器官組織中也有表達(dá)。在肝臟，M

4、RP2主要位于肝細(xì)胞的頂膜側(cè)，亦即小管側(cè)，它是膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝中的一個重要蛋白，主要生理作用是向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)陰離子復(fù)合物，其重要轉(zhuǎn)運(yùn)底物為結(jié)合膽紅素，其次還有二價的硫酸鹽、谷胱甘肽、其它葡萄糖醛酸結(jié)合物以及多種藥物。MRP2的功能障礙可導(dǎo)致血液內(nèi)膽紅素的堆積，在人體可表現(xiàn)為Dubin-Johnson綜合征。因此MRP2是維持膽汁酸代謝平衡中非常重要的一個跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。膽汁淤積時伴有許多炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子水平的升高，如腫瘤壞死因子α(tu

5、mor necrosis factorα，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)6等，許多研究也提示這些炎癥因子不僅是繼發(fā)于膽汁淤積的炎癥反應(yīng)，同時也對肝細(xì)胞膜表面的各種膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)膽道梗阻時IL-18表達(dá)水平增高，解除梗阻后IL-18水平可回復(fù);另有研究發(fā)現(xiàn)在壞死性腸炎動物模型中IL-18和肝臟MRP2可能存在負(fù)相關(guān)。這些研究結(jié)果提示IL-18可能對MRP2的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，但尚無研究證實并闡述機(jī)

6、制。
　　目的：本研究擬從HepG2細(xì)胞及大鼠兩個水平探討IL-18在調(diào)節(jié)MRP2表達(dá)中的作用及分子機(jī)制。
　　方法：1.HepG2細(xì)胞中IL-18通過NF-κB/FXR/YY1通路下調(diào)MRP2的表達(dá)。
　　1.1以IL-18刺激體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，用real-time qPCR及蛋白質(zhì)印記(westernblot)方法檢測MRP2的mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，確定IL-18對MRP2的具有下調(diào)作用，且呈劑

7、量與時間依賴關(guān)系。
　　1.2確定在HepG2細(xì)胞中IL-18可以下調(diào)MRP2表達(dá)后，再以western blot方法檢測篩選IL-18刺激后存在顯著差異性表達(dá)并可調(diào)控MRP2轉(zhuǎn)錄的核因子，篩選后發(fā)現(xiàn)FXR在IL-18刺激后有顯著的降低;進(jìn)一步以不同濃度的IL-18刺激HepG2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR表達(dá)的降低與IL-18呈劑量依賴關(guān)系，提示IL-18可抑制FXR的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而FXR已被明確證實可促進(jìn)MRP2的轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)XR的抑制可能

8、導(dǎo)致了MRP2的抑制。但因為調(diào)控MRP2表達(dá)的核受體不僅僅有FXR，為確定MRP2的降低與FXR有直接關(guān)系，進(jìn)一步檢測了FXR的另一個下游基因CYP7A1，發(fā)現(xiàn)它隨著FXR的下降而升高，由此我們確定MRP2的降低確系與FXR的降低有關(guān)。
　　1.3在篩選IL-18刺激HepG2細(xì)胞后差異性表達(dá)的核因子、轉(zhuǎn)錄因子過程中還發(fā)YY1表達(dá)明顯增高，且與IL-18呈劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步以YY1(short hairpin RNA，ShRNA

9、)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，抑制YY1表達(dá)，再以IL-18刺激HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)原本接受IL-18刺激后下調(diào)的FXR和MRP2表達(dá)均有明顯回升，提示轉(zhuǎn)錄因子YY1參與了IL-18下調(diào)FXR及MRP2的過程。這與文獻(xiàn)報道的YY1可直接結(jié)合于FXR轉(zhuǎn)錄子啟動區(qū)并抑制FXR的轉(zhuǎn)錄相符。
　　1.4以IL-18刺激HepG2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)核蛋白水平的p65升高、磷酸化p65蛋白升高，提示NF-κB通路的激活。進(jìn)一步以p65 ShRNA干擾NF-κ

10、B通路后發(fā)現(xiàn)，原本接受IL-18刺激后升高的YY1表達(dá)出現(xiàn)回落，提示YY1的表達(dá)升高是通過NF-κB通路的激活來調(diào)控的。
　　2.在膽道結(jié)扎的Sprague Dawley(SD)大鼠肝組織中觀察到MRP2、NF-κB、FXR、YY1、IL-18等的變化趨勢符合體外細(xì)胞實驗的結(jié)果。
　　2.1相對于假手術(shù)組，BDL組大鼠肝組織中IL-18 mRNA水平顯著升高，證實了膽汁淤積時肝組織內(nèi)IL-18的表達(dá)是明顯升高的，首先驗證本研

11、究的基礎(chǔ)問題，并與其它有關(guān)膽汁淤積時IL-18血清水平升高的報道相符。
　　2.2相對于假手術(shù)組，BDL大鼠肝組織中NF-κB p65的mRNA水平明顯增加，細(xì)胞核中的p65蛋白表達(dá)量明顯增多，p65的磷酸化水平也明顯升高，驗證了膽汁淤積時肝組織內(nèi)NF-κB通路激活水平是增高的。
　　2.3相對于假手術(shù)組，BDL大鼠肝組織中YY1的mRNA及蛋白水平明顯升高，而FXR和MRP2的mRNA及蛋白水平則明顯降低，符合體外細(xì)胞實驗

12、的結(jié)果;
　　2.4在大鼠肝組織中以染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation， ChIP）的方法檢測FXR與MRP2基因啟動子區(qū)的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)在BDL大鼠肝組織中與MRP2啟動子區(qū)結(jié)合的FXR顯著降低，進(jìn)一步證實了膽汁淤積時FXR表達(dá)的減少與MRP2的表達(dá)降低直接相關(guān)。
　　多耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）是膽汁酸代謝平衡中的關(guān)鍵分子。生理狀態(tài)下MRP2分子呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，以維持膽汁酸的正常

13、排泄，但是在膽汁淤積時其表達(dá)量卻明顯降低，機(jī)制尚不清楚。許多研究已證實，在發(fā)生膽汁淤積時，許多細(xì)胞因子都表現(xiàn)出對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重要調(diào)節(jié)作用。IL-18在膽汁淤積時也會出升高，但其是否也參與了膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控尚未可知。近期有研究顯示，在小鼠壞死性腸炎模型中發(fā)現(xiàn)，IL-18與肝臟MRP2之間存在負(fù)相關(guān)性。假設(shè)膽汁淤積時，IL-18的升高可能不僅僅炎癥反應(yīng)（機(jī)體的一種防御性反應(yīng)）的一部分，它也可能對膽汁淤積的發(fā)生發(fā)展有影響，而這種影響極

14、有可能是通過調(diào)節(jié)MRP2的表達(dá)來實現(xiàn)的。
　　結(jié)果：FXR表達(dá)的下調(diào)與IL-18之間也存在劑量依賴關(guān)系，與MRP2表達(dá)下調(diào)趨勢一致。而為了更進(jìn)一步證明MRP2的下調(diào)確與FXR相關(guān)，還檢測了FXR調(diào)控下游的另外一個基因CYP7A1的表達(dá)。FXR具有間接抑制CYP7A1表達(dá)的作用。檢測發(fā)現(xiàn)IL-18抑制FXR表達(dá)的同時，CYP7A1的表達(dá)出現(xiàn)明顯升高，其另一個下游基因MRP2表達(dá)明顯降低，F(xiàn)XR兩個下游基因均出現(xiàn)符合FXR變化趨勢的變

15、化規(guī)律，更進(jìn)一步證實IL-18誘導(dǎo)的MRP2表達(dá)下調(diào)可能直接由FXR的下調(diào)所導(dǎo)致。但是FXR的抑制又似乎不是IL-18刺激的直接結(jié)果。近期一項研究發(fā)現(xiàn)YY1可以結(jié)合到FXR基因內(nèi)含子的一個特殊反應(yīng)原件上，從而抑制FXR基因的轉(zhuǎn)錄。于是推測是否膽汁淤積時FXR表達(dá)的降低也與YY1有關(guān)。檢測了IL-18刺激后HepG2細(xì)胞中YY1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)YY1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈明顯升高趨勢，且與IL-18存在劑量依賴關(guān)系。為進(jìn)一步驗證YY

16、1表達(dá)升高是否導(dǎo)致了FXR表達(dá)的降低，對HepG2細(xì)胞進(jìn)行了YY1 ShRNA干擾。發(fā)現(xiàn)YY1干擾后的HepG2細(xì)胞，再接受IL-18刺激后，其FXR和MRP2的表達(dá)水平僅僅出現(xiàn)輕度的下降，其下降的幅度明顯小于普通HepG2細(xì)胞接受IL-18刺激后的FXR及MRP2表達(dá)下降的幅度。也就是說，YY1基因干擾削弱或部分阻斷了IL-18抑制FXR和MRP2表達(dá)的效應(yīng)。換言之，YY1參與了IL-18抑制FXR和MRP2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。最后還進(jìn)一

17、步闡明了IL-18促進(jìn)YY1表達(dá)的機(jī)制。通過檢測NF-κBp65亞基在細(xì)胞核內(nèi)的含量及其磷酸化水平，證實IL-18可激活HepG2細(xì)胞的NF-κB信號通路。進(jìn)一步以p65 ShRNA阻斷了NF-κB信號通路后發(fā)現(xiàn)，IL-18誘導(dǎo)的YY1表達(dá)升高也隨著NF-κB的抑制而被抑制，同時原本接受IL-18刺激后被抑制的FXR和MRP2表達(dá)水平卻出現(xiàn)回升。簡言之，IL-18刺激的YY1表達(dá)是通過NF-κB信號通路傳導(dǎo)的。
　　首先檢測了假手

18、術(shù)組和BDL組大鼠肝組織中IL-18 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果提示BDL大鼠肝組織中IL-18 mRNA水平是明顯增高的，證實了整個研究的基礎(chǔ)。這也與文獻(xiàn)報道膽汁淤積時血清IL-18水平升高相一致。然后發(fā)現(xiàn)BDL大鼠肝組織中p65的基因轉(zhuǎn)錄水平是增高的，肝組織核蛋白水平的p65含量是增多了，而磷酸化p65的表達(dá)量也增多，證實了膽汁淤積時NF-κB通路是激活的。其次，檢測到BDL大鼠肝組織中YY1的表達(dá)上調(diào)，而FXR與MRP2的表達(dá)明顯下

19、調(diào)，均與細(xì)胞水平中IL-18刺激后以上各因子的表達(dá)變化趨勢一致。相關(guān)性分析則進(jìn)一步顯示了各因子之間均存在良好的相關(guān)性。除FXR外，MRP2還受到其它核受體的調(diào)控。為了進(jìn)一步證實膽汁淤積時MRP2的下調(diào)與FXR的關(guān)系，在大鼠肝組織中進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)實驗。ChiP結(jié)果顯示，BDL大鼠肝組織中與MRP2啟動子區(qū)域相結(jié)合的FXR數(shù)量明顯少于假手術(shù)組，證實了膽汁淤積中由

20、于FXR自身轉(zhuǎn)錄水平的下降，使得其與MRP2啟動子區(qū)的結(jié)合也是降低的，從而削弱了其促進(jìn)MRP2轉(zhuǎn)錄的調(diào)控能力，導(dǎo)致MRP2表達(dá)的下降。
　　動物實驗進(jìn)一步驗證了細(xì)胞實驗中各因子的變化情況，證實了膽汁淤積時肝組織內(nèi)IL-18水平的上調(diào)和NF-κB信號通路的激活，證實了YY1表達(dá)的上調(diào)和FXR、MRP2表達(dá)的下調(diào)，并證實了FXR的下調(diào)是導(dǎo)致MRP2下調(diào)的主要原因之一。
　　結(jié)論：本研究在HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IL-18通過抑制FX

21、R的表達(dá)而誘導(dǎo)MRP2的表達(dá)降低;同時發(fā)現(xiàn)IL-18通過激活的NF-κB通路上調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子YY1的表達(dá)，而上調(diào)的YY1與FXR抑制明顯相關(guān)。在進(jìn)一步的動物實驗中證實了膽汁淤積時IL-18的升高、NF-κB通路的激活、YY1表達(dá)的增高以及FXR和MRP2表達(dá)的降低，并且證實FXR表達(dá)的降低直接導(dǎo)致了MRP2的表達(dá)下降。綜上所述，本研究揭示了膽汁淤積時MRP2下調(diào)的一種可能機(jī)制，即增高的IL-18水平通過激活NF-κB通路而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子YY