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文檔簡介
1、目的:
膽汁淤積(Cholestasis)是由多種肝臟疾病引起的臨床綜合癥,常與原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、Dubin-Johnson綜合癥等相伴。肝炎、藥物中毒、梗阻、妊娠等均可引起膽汁淤積。就分子水平而言,膽汁淤積的發(fā)生主要與位于肝細胞表面的膽酸轉(zhuǎn)運蛋白MDR1(多藥耐藥蛋白1,Multidrug resistance protein1)、MDR2(多藥耐藥蛋白2,Multidrug resistance pr
2、otein2)、MRP2(多要耐藥相關(guān)蛋白2,Multidrugresistance-associated protein2)、MRP3(多藥耐藥相關(guān)蛋白3,Multidrugresistance-associated protein3)、MRP4(多要耐藥相關(guān)蛋白4,Multidrugresistance-associated protein4)等的表達異常相關(guān)。其中,MRP3、MRP4位于肝細胞基底側(cè)膜,主要負責將有機陰離子、膽紅素
3、、藥物等由肝細胞排入血液,而MRP2、MDR1、MDR2等則位于肝細胞膽管膜面,主要將一些內(nèi)源性或外源性的結(jié)合產(chǎn)物排入膽管。相關(guān)文獻報道,膽汁淤積發(fā)生后,位于肝細胞膽管膜面的MRP2表達下降,而位于肝細胞基底側(cè)膜的MRP3、MRP4的表達則增高,以代償MRP2的部分功能。目前,臨床治療膽汁淤積主要依靠FXR的激動劑UDCA,但是UDCA并不適用于所有人群,此外,還有利福平、苯巴比妥等,但其都具有自身局限性,而正在開發(fā)的新藥GW4064和
4、TNT747目前還處于臨床試驗階段。因此,臨床亟需研發(fā)新的更有效的藥物。
川西獐牙菜為我國藏藥八寶——“藏茵陳”的主要原生植物之一,常年生長于海拔2000-5000米的青藏高原,其主要有效成分為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸、芒果苷、苦龍膽苷、當藥醇苷等,具有清肝利膽,祛熱退黃之功效,尤其適用于黃疸型肝炎、病毒性肝炎,是我國治療各種肝病的傳統(tǒng)藥材[7-9]。但其清肝利膽的具體分子機制并不明確,加之成分復雜多樣,因此難以被國際醫(yī)
5、學界接受。臨床治療膽汁淤積的常用藥物“尤思弗”其主要成分為UDCA,即是從熊膽汁中提取出的有效成分,而我國古代便有使用熊膽汁治療各種肝病的傳統(tǒng)。受“尤思弗”發(fā)現(xiàn)、研究、推廣的啟發(fā),我們對治療各種肝病,具有“清肝利膽”作用的藏藥“藏茵陳”進行研究,提取其主要原生植物——川西獐牙菜的醇提物,用以干預膽汁淤積的動物模型,以期能夠發(fā)現(xiàn)新的治療膽汁淤積的有效藥物,彌補UCDA的不足,同時也為保護我國傳統(tǒng)醫(yī)藥,維護自主知識產(chǎn)權(quán)做出貢獻。
6、方法:
1.建立膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型,并對其進行藥物干預,膽汁淤積模型的建立見參考文獻。將15只SD大鼠使用隨機數(shù)字表法進行分組:(1)川西獐牙菜醇提物組、(2)UDCA組、(3)生理鹽水組,每組5只。分別用川西獐牙菜醇提物、UDCA、生理鹽水連續(xù)灌胃7d,7d后處死大鼠,收集血液、尿液及肝臟組織。血清學檢測肝損傷指標和黃疸指標,HE染色觀察肝臟損傷情況,以明確川西獐牙菜對膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型是否具有保護作用。
7、r> 2.藥物干預正常大鼠:使用隨機數(shù)字表法將10只正常雄性SD大鼠分為2組:(1)川西獐牙菜醇提物組、(2)生理鹽水組,每組5只。分別用川西獐牙菜醇提物和生理鹽水連續(xù)灌胃7d,7d后處死大鼠收集肝臟組織。提取大鼠肝臟RNA和總蛋白,分別在mRNA水平和蛋白水平檢測肝細胞膽酸轉(zhuǎn)運蛋白Mrp3、Mrp4、Mrp2、Mdr1、Mdr2、Ostα、Ostβ的表達變化和核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、Lrh-1及核受體Rxrα、Rarα、Vdr、Pxr、
8、Car等的表達變化,最后分析其相關(guān)性,尋找川西獐牙菜醇提物對膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型保護作用的可能分子機制。
結(jié)果:
1.藥物干預膽道結(jié)扎的大鼠膽汁淤積模型:分別用100mg/kg body w.t.的川西獐牙菜醇提物、UDCA(陽性對照)、生理鹽水(陰性對照)連續(xù)灌胃大鼠7d,收集標本,血清學結(jié)果顯示:與生理鹽水組相比,川西獐牙菜組和UDCA組的肝損傷指標和黃疸指標明顯低于生理鹽水組,且川西獐牙菜組的各項指標較U
9、DCA組降低,具有統(tǒng)計學意義。H.E.染色實驗結(jié)果證實川西獐牙菜組大鼠肝臟損傷情況明顯輕于UDCA組和生理鹽水組。
2.藥物干預正常大鼠:以生理鹽水為陰性對照,100mg/kg body w.t.的川西獐牙菜醇提物連續(xù)灌胃大鼠7d,收集大鼠肝臟組織標本后提取RNA和蛋白,利用RT-qPCR和Westem Blot技術(shù)分別檢測肝臟膽酸轉(zhuǎn)運蛋白Mrp2、Mrp3、Mrp4、Mdr1、Mdr2等和核受體Pxr、Rxrα、Rarα、V
10、dr以及核轉(zhuǎn)錄因子Lrh-1、Nrf2等的表達變化,結(jié)果顯示:
(1)膽酸轉(zhuǎn)運蛋白:在mRNA水平,與陰性對照組相較,Mrp4、Mrp3表達上升明顯,統(tǒng)計學分析顯示:Mrp4的表達增高了2.1倍,Mrp3的表達增高了1.7倍,結(jié)果顯著,具備統(tǒng)計學意義;在蛋白水平,川西獐牙菜組Mrp4、Mrp3表達亦增高,其中Mrp4表達增高2.5倍,Mrp3表達增高3.0倍,結(jié)果顯著,具有統(tǒng)計學意義。而Mdr1、Mdr2、Rxrα、Rarα、
11、Vdr等無明顯變化。同時,免疫熒光結(jié)果也顯示,川西獐牙菜醇提物組其樣本Mrp4、Mrp3的表達明顯強于陰性對照組。
(2)核受體和核轉(zhuǎn)錄因子:在mRNA水平,相比于陰性對照組,川西獐牙菜醇提物組Nrf2表達增高1.8倍,Lrh-1表達增高1.4倍;同時,在蛋白水平,與陰性對照組相比,川西獐牙菜醇提物組Nrf2表達增高2.3倍,Lrh-1表達增高1.3倍,Pxr表達增高1.8倍,Vdr表達增高1.8倍,結(jié)果顯著,具有統(tǒng)計學意義。
12、
(3)膽酸轉(zhuǎn)運蛋白與核受體和核轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性分析:由于在mRNA水平和蛋白水平均發(fā)現(xiàn):相較于陰性對照組,川西獐牙菜醇提物組肝細胞表面膽酸轉(zhuǎn)運蛋白Mrp4、Mrp3和核受體Lrh-1、核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達增高,通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn):川西獐牙菜可能通過Nrf2刺激Mrp4使其表達增高,而與Mrp3無關(guān)。
結(jié)論:
(1)與生理鹽水組相比,川西獐牙菜醇提物和UDCA均具有減輕肝損傷的作用,且川西獐牙菜醇提物
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