華細(xì)辛肉桂酸-4-羥基化酶基因的克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析.pdf

1、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）催化反式肉桂酸在苯環(huán)4位上的羥基化反應(yīng)生成4-香豆酸，是苯丙素類化合物生物合成共有途徑的關(guān)鍵酶之一。細(xì)辛藥理活性部位揮發(fā)油中的主要組成成分甲基丁香酚等芳香族化合物都屬于苯丙素類化合物。因此，分離細(xì)辛C4H基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證，是闡明細(xì)辛主要活性成分生物合成分子調(diào)控機(jī)制、掌握細(xì)辛藥效成分積累動(dòng)態(tài)規(guī)律、開展細(xì)辛種質(zhì)遺傳改良、提升細(xì)辛藥材品質(zhì)等的理論基礎(chǔ)。
　　本研究基于同源克隆的原理和方法，通過在Geneb

2、ank中搜索不同植物類群肉桂酸-4-羥基化酶基因C4H的序列并進(jìn)行比對，查找該基因的保守序列。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)簡并引物，以華細(xì)辛總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增獲得保守片段，大小約為850 bp。依據(jù)獲得的保守片段的序列信息，設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增特異引物，采用cDNA末端快速擴(kuò)增法分別得到華細(xì)辛C4H基因5'端片段和3'端片段。經(jīng)5'端片段、保守片段和3'端片段拼接，得到堿基數(shù)為1698 bp的華細(xì)辛C4H cDNA全長。利用在線分析工具及軟

3、件，對華細(xì)辛C4H基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，了解其編碼蛋白的各級結(jié)構(gòu)。利用熒光定量PCR方法，比較華細(xì)辛C4H基因在不同生長時(shí)期和不同組織部位的表達(dá)量，結(jié)果顯示該基因在華細(xì)辛幼苗期的表達(dá)量大于花期，根中的表達(dá)量遠(yuǎn)大于葉柄和葉片中的表達(dá)量。
　　本研究以細(xì)辛三個(gè)基源物種之一的華細(xì)辛為材料，首次從細(xì)辛類中藥中分離獲得了C4H基因，對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)水平分析，為細(xì)辛活性成分生物合成表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，以及細(xì)辛遺傳品質(zhì)的改良