氬氦冷凍消融聯(lián)合GM-CSF治療膠質(zhì)瘤小鼠的療效及其對小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞免疫功能影響.pdf

1、本文分以下兩章進(jìn)行探討：
　　第一章 C57BL/6小鼠GL261小鼠腦膠質(zhì)瘤模型建立及氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療的生存期觀察
　　目的：
　　觀察氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療荷膠質(zhì)瘤小鼠的療效。
　　內(nèi)容：
　　(1)荷膠質(zhì)瘤小鼠模型的建立;
　　(2)觀察不同治療方案對膠質(zhì)瘤小鼠的治療效果，包括一般情況及腫瘤大小等;
　　(3)荷膠質(zhì)瘤小鼠生存期。
　　方法:
　　1、荷膠質(zhì)瘤

2、小鼠模型建立及分組:GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代后，制備單細(xì)胞懸液，種植于C57BL/6小鼠背部靠近臀部處皮下，建立小鼠膠質(zhì)瘤模型;腫瘤組織行HE染色進(jìn)行腫瘤組織的形態(tài)學(xué)觀察，確定荷膠質(zhì)瘤小鼠模型的成功建立;造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型對照組、單純GM-CSF注射組、單純氬氦冷凍組和氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組。
　　2、觀察各組小鼠腫瘤大小及荷瘤小鼠的生存期:接種后每天密切觀察小鼠活動(dòng)情況:小鼠迸食是否正常，毛色是否光滑整齊

3、，背部接種部位是否膨隆;接種后每3天測量一次小鼠的體重，隔日觀察小鼠皮下膠質(zhì)瘤的成瘤及生長情況，根據(jù)測量的腫瘤最大長徑A和最小寬徑B，計(jì)算腫瘤的體積(其體積為A×B2/2);記錄小鼠生存時(shí)間，以70天為觀察終點(diǎn)，繪制生長曲線圖。
　　3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以(x)±s表示。各個(gè)治療組小鼠的生存時(shí)間記錄為:平均生存時(shí)間（天）±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Kaplan-Meier生存分析法描繪各個(gè)治療

4、組小鼠生存分析曲線，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)，多重比較采用Bonferroni校正，都與Cryo+GM-CSF組比較，共三次，校正后檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05/3=0.0167;各治療組小鼠腫瘤體積的變化采用重復(fù)測量的方差分析，各時(shí)間點(diǎn)之間的多重比較采用LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、GL261細(xì)胞呈貼壁生長，狀態(tài)良好;小鼠接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，進(jìn)食未見明顯異常，活動(dòng)稍受限，毛發(fā)光澤度較前稍差

5、，接種部位隨時(shí)間延長逐漸膨隆，表面無破潰、出血;種植腫瘤細(xì)胞后第14-16天，肉眼可見小鼠背部接種部位明顯膨隆，腫塊大小約為2.5-3.0cm3，表面無破潰;腫瘤組織光學(xué)顯微鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞呈圓形、梭形或多角形，排列紊亂，細(xì)胞核呈圓形或不規(guī)則形，染色質(zhì)深染，病理性核分裂象活躍，局部可見壞死區(qū)域;
　　2、動(dòng)態(tài)觀察不同治療組荷瘤小鼠腫瘤大小的變化:
　　單純GM-CSF注射治療可以延緩小鼠膠質(zhì)瘤生長，但不能殺滅腫瘤，抑制腫瘤

6、生長;單純氬氦冷凍治療可以在一定程度上減小了腫瘤的體積;而二者聯(lián)合治療后可以呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，明顯抑制了腫瘤的生長
　　3、各種不同治療方案對荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響:各組小鼠平均生存時(shí)間（天）分別為:模型對照組38.10±1.77，單純GM-CSF注射組43.40±2.14，單純氬氦冷凍組63.80±2.77，氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組69.80±0.19，氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF組小鼠平均生存時(shí)間最長，其次是單純氬氦冷凍組，單純

7、GM-CSF注射組和模型對照組小鼠均未存活至觀察終點(diǎn)，各組生存時(shí)間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=47.300，P＜0.001）。
　　結(jié)論:
　　1、荷膠質(zhì)瘤小鼠模型成功建立:該方法可以成功建立C57BL/6小鼠GL261膠質(zhì)瘤模型，形成的腫瘤組織光鏡下觀察符合惡性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。建立的膠質(zhì)瘤模型生長期符合預(yù)期，種植腫瘤細(xì)胞后第14-16天，肉眼可見小鼠背部接種部位明顯膨隆，腫塊大小約為2.5-3.0cm3，表面無破潰。

8、適合行各種治療干預(yù)。
　　2、不同治療方案對膠質(zhì)瘤小鼠的治療效果:單純GM-CSF注射治療可以延緩小鼠膠質(zhì)瘤生長，但不能殺滅腫瘤，抑制腫瘤生長;單純氬氦冷凍治療可以在一定程度上減小了腫瘤的體積;而二者聯(lián)合治療后可以呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，明顯抑制了腫瘤的生長。
　　3、氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療可以延長荷膠質(zhì)瘤小鼠的生存期。
　　第二章 氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療對荷腦膠質(zhì)瘤小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響
　　目的：

9、
　　探討氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療荷膠質(zhì)瘤小鼠是否可通過引起脾臟DCs活化來引起特異性抗腫瘤免疫，為進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤免疫治療提供一個(gè)理論依據(jù)。
　　內(nèi)容：
　　(1)荷膠質(zhì)瘤小鼠模型的建立;
　　(2)動(dòng)態(tài)觀察不同治療方案治療前后小鼠脾臟DCs數(shù)量變化及活化情況，明確氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF是否可以有效活化DCs從而將腫瘤特異性抗原呈遞給T細(xì)胞，激活機(jī)體抗腫瘤免疫以殺死膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
　　方法：
　

10、　1、荷膠質(zhì)瘤小鼠模型建立及分組:將成功種植GL261細(xì)胞并成瘤的荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型對照組、單純GM-CSF注射組、單純氬氦冷凍組和氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療組，每組20只。各組動(dòng)物分干預(yù)治療前、治療后7、14、21d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在各組內(nèi)隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。
　　2、免疫組織化學(xué)法檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)DCs表面標(biāo)記CD11c在脾臟的表達(dá)情況。
　　3、流式細(xì)

11、胞術(shù)檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)的脾臟DCs的活化情況。
　　4、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞IFN-γ的分泌水平。
　　5、LDH實(shí)驗(yàn)檢測治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)的殺傷活性。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用21.0

12、統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以(x)±s表示。不同組間不同時(shí)間點(diǎn)采用2×2析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較采用LSD。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、光鏡下觀察:CD11c主要表達(dá)于細(xì)胞膜表面，CD11c+細(xì)胞(DCs)主要分布于脾臟邊緣區(qū)、脾索和淋巴濾泡處，體積較大，細(xì)胞核不規(guī)則。
　　2、免疫組化法檢測脾臟中CD11c+細(xì)胞數(shù)在各個(gè)治療組和不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化情況:
　　單純GM-CSF注射

13、治療和單純氬氦冷凍治療均可增加脾臟組織內(nèi)DCs數(shù)量，但氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療對脾臟DCs數(shù)量的增加更明顯，從時(shí)間變化趨勢上看，聯(lián)合治療組DCs數(shù)量增加更明顯，持續(xù)時(shí)間更長。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟單位體積內(nèi)DCs活化(CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD86+)在各治療組和不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化情況:
　　單純GM-CSF注射治療并不能增加脾臟組織活化DCs數(shù)量，單純氬氦冷凍組脾臟DC細(xì)胞活化數(shù)量雖有所增加，

14、但隨時(shí)間延長迅速下降，而氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療能顯著增加脾臟組織內(nèi)活化DCs數(shù)量，且持續(xù)時(shí)間長。說明GM-CSF的免疫增強(qiáng)作用在有氬氦冷凍釋放的抗原基礎(chǔ)上起協(xié)同作用，大大提高了DCs的活化效率。
　　4、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各治療組在治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞IFN-γ的分泌水平:
　　單純GM-CSF治療并不能增加脾臟組織IFN-γ分泌量，單純氬氦冷凍雖能一定程度上增加脾臟IFN

15、-γ分泌量，但升高效果并不十分顯著，而二者聯(lián)合治療能顯著增加脾臟IFN-γ分泌量，且能在較長時(shí)間內(nèi)維持高分泌量。
　　5、LDH實(shí)驗(yàn)檢測治療前和治療后7天、14天、21天不同時(shí)間點(diǎn)脾臟細(xì)胞CTLs殺傷活性:
　　單純GM-CSF注射治療并不能增加脾臟組織CD8+CTLs的殺傷活性，單純氬氦冷凍治療能一定程度上增強(qiáng)脾臟CD8+CTLs的殺傷活性，而氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF治療后脾臟CD8+CTLs的殺傷活性明顯增加，且持續(xù)時(shí)間

16、較長。
　　結(jié)論：
　　采用免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞檢測、ELISA實(shí)驗(yàn)和LDH實(shí)驗(yàn)等多種方法檢測小鼠脾臟DCs的免疫功能變化，結(jié)果表明氬氦冷凍聯(lián)合GM-CSF注射治療能夠增加DCs數(shù)量，增強(qiáng)脾臟DCs的活化，在體內(nèi)促進(jìn)DCs免疫功能活化，進(jìn)而遞呈膠質(zhì)瘤抗原至T淋巴細(xì)胞，從而激活初始型T細(xì)胞，誘導(dǎo)出Th1型免疫應(yīng)答，以及產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞特異性CTL殺傷作用，其中GM-CSF對氬氦冷凍起到了協(xié)同和促進(jìn)作用。本研究利用氬氦冷凍釋放的