轉(zhuǎn)GM-CSF基因腫瘤疫苗治療小鼠非小細胞肺癌的實驗研究.pdf

1、目的：1）通過把GM-CSF基因轉(zhuǎn)入小鼠LLC肺癌細胞，建立可靠和有效的腫瘤疫苗，并且對其進行鑒定是否能正確表達 GM-CSF基因；2）創(chuàng)建穩(wěn)定并且可靠的Lewis肺癌C57BL/6小鼠皮下種植瘤動物模型，并為隨后進行的轉(zhuǎn)基因腫瘤疫苗免疫治療實驗研究奠定基礎(chǔ)；3）研究在小鼠體內(nèi)由轉(zhuǎn) GM-CSF基因腫瘤疫苗所誘發(fā)的抗腫瘤效應(yīng)，研究并探討小鼠轉(zhuǎn)GM-CSF基因的肺癌細胞疫苗在其所激發(fā)的細胞免疫反應(yīng)和抗腫瘤免疫排斥治療作用，并且從中探討其在

2、細胞免疫中的可能作用機制。
　　方法：1）將MG-CSF作為目的基因與載體相連接，構(gòu)建重組GM-CSF-EGFP的腺病毒載體，并對表達目的基因的重組穿梭質(zhì)粒進行鑒定。將包含目的基因的重組穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細胞，同源重組產(chǎn)生并進行鑒定該重組腺病毒。將含有GM-CSF基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠LLC肺癌細胞，鑒定轉(zhuǎn)染效率，并且連續(xù)檢測轉(zhuǎn)染后的腫瘤細胞表達GM-CSF蛋白的量，然后通過放射線照射將其滅活制備成腫瘤疫苗；

3、2）給每只C57BL/6近交系小鼠注射2×106個LLC肺癌細胞在其右側(cè)腋窩的皮下，建立移植性腫瘤模型，觀察生存質(zhì)量、腫瘤體積變化和帶瘤生存期，并進行病理學檢查；3）將實驗小鼠隨機分為預(yù)防組和實驗治療組。其中預(yù)防組細分為腫瘤疫苗組、轉(zhuǎn)GM-CSF基因腫瘤疫苗組、空白對照組；治療組細分為空白對照組、腫瘤疫苗組、腫瘤疫苗＋化療組、單純化療組、轉(zhuǎn)GM-CSF基因腫瘤疫苗組、轉(zhuǎn)GM-CSF基因腫瘤疫苗組＋化療組；4）預(yù)防組在先行預(yù)防免疫接種后，

4、再行接種Lewis肺癌腫瘤細胞，觀察并且記錄預(yù)防組小鼠的成瘤時間、成瘤率、形成腫瘤后的存活時間、ELISA法檢測小鼠外周血內(nèi)細胞因子的變化、流式細胞儀檢測小鼠外周血淋巴細胞亞群、并進行脾細胞殺傷實驗等；5）治療組在先接種Lewis肺癌腫瘤細胞制成腫瘤模型后，給予不同組合的化療及腫瘤疫苗實驗治療，觀察并記錄上述指標的變化；6）所有的計量資料數(shù)據(jù)都采用均數(shù)±標準差（-x±s）表示處理，并進行方差齊性檢驗（采用Levene分析法），應(yīng)用SPS

5、S16.0統(tǒng)計軟件包，預(yù)防組與實驗治療組當中各組間差異采用單因素方差分析，并且作多個樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗；組內(nèi)差異用方差分析法來對組內(nèi)重復測量資料進行數(shù)據(jù)分析，小鼠的生存差異用Kaplan-Meier生存曲線進行評估。P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：1）構(gòu)建了Ad5-GMCSF-EGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Lewis肺癌腫瘤細胞后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察和ELISA法檢測，可見細胞內(nèi)有綠色熒光蛋白及GM-CSF的表達，GM-C

6、SF分泌量達到實驗要求，可以制備轉(zhuǎn)基因腫瘤疫苗；2）成功建立 C57BL/6小鼠移植性腫瘤模型，操作簡便，觀察方便，符合實驗要求；3）各組實驗研究均證明機體在接種轉(zhuǎn)GM-CSF基因的Lewis肺癌腫瘤疫苗后可以被有效刺激出特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，其中CD8＋T細胞的被活化后大量增殖是其主要表現(xiàn)，在轉(zhuǎn)目的基因瘤苗組和轉(zhuǎn)目的基因瘤苗＋順鉑組中，小鼠的CD8＋T細胞含量均遠高于其他各組（P＜0.01）；4）在免疫接種轉(zhuǎn)GM-CSF基因的Lew

7、is肺癌腫瘤疫苗后，預(yù)防組小鼠的成瘤時間明顯晚于其他各組（P＜0.01），相對應(yīng)的帶瘤存活時間也明顯較其他各組延長（P＜0.01）；5）轉(zhuǎn) GM-CSF基因腫瘤疫苗＋化療組的小鼠生存期較其他各組明顯被延長（P＜0.01）。
　　結(jié)論：1）成功建立含有GM-CSF基因的重組腺病毒，將其轉(zhuǎn)染給Lewis肺癌細胞并鑒定，經(jīng)連續(xù)檢測小鼠肺癌細胞GM-CSF蛋白的含量證實其能夠表達符合實驗要求的目的基因，并且用放射線照射將其滅活用以制備轉(zhuǎn)G