GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細胞治療缺血性腦血管病及其機制研究.pdf

1、缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICD)作為一類有著較高致死、致殘率的神經(jīng)科常見疾病嚴重危害著人類的生命健康，給患者和社會造成了巨大的負擔。目前臨床上治療該病的主要方法是藥物治療，但這些治療并不能有效逆轉(zhuǎn)已發(fā)生梗死的腦組織。因此，迫切需要尋找一種切實有效的修復受損腦組織的治療方法以減輕腦缺血損傷，最大程度恢復神經(jīng)功能缺損。 傳統(tǒng)觀點認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后，由于內(nèi)在的再生能力差

2、和外在的微環(huán)境的抑制，壞死的神經(jīng)組織不能自行恢復。成體神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)則打破了這一傳統(tǒng)觀點，給缺血性腦血管病的治療帶來了曙光。目前用于中樞神經(jīng)移植的供體細胞主要有：胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)；神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)；骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)；臍血干細胞等。BMSCs是幾年前才被確認的成體干細胞，因其具有取材方便

3、、培養(yǎng)容易、多向分化潛能、易于接受外來基因、可取材于自身不涉及倫理道德問題等等優(yōu)點，成為了醫(yī)學領(lǐng)域乃至整個生命科學領(lǐng)域的研究熱點。 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor,GM-CSF)是一種常見的多功能造血細胞因子，它能動員骨髓、促進造血干細胞的增殖和分化、抑制白細胞的凋亡，從而提高外周血中白細胞的數(shù)目。最近，有多個學者報道GM-CSF具有神

4、經(jīng)保護作用，它能促進神經(jīng)前體細胞分化、對抗神經(jīng)細胞凋亡并促進神經(jīng)系統(tǒng)功能的改善。本課題研究內(nèi)容包括外源性GM-CSF誘導體外培養(yǎng)的BMSCs分化為神經(jīng)細胞及其機制的研究、利用BMSCs為細胞載體轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的研究以及將GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植治療大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型的療效觀察，并對GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植治療缺血性腦血管病的作

5、用機理進行了初步探索。 本課題分成以下四個部分： 第一章：體外培養(yǎng)的大鼠骨髓基質(zhì)細胞可分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 目的：研究體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs可否分泌GM-CSF并觀察BMSCs上GM-CSF受體(GM-CSF receptor，GM-CSFR)表達情況，為進一步探討GM-CSF對BMSCs的誘導作用機制提供實驗依據(jù)并為后一步的實驗奠定基礎(chǔ)。 方法：培養(yǎng)和鑒定BMSCs；采用RT-PCR和EL

6、ISA方法，分別從mRNA和蛋白水平測定體外培養(yǎng)的BMSCs中GM-CSF的表達；并采用Western blot和RT-PCR方法檢測第3、4、5、6代BMSCs上GM-CSFR的表達。 結(jié)果：RT-PCR檢測顯示BMSCs中有較弱濃度的GM-CSF mRNA表達。在蛋白水平，采用ELISA法在培養(yǎng)的第一到第六代BMSCs的培養(yǎng)液和細胞蛋白中均可檢測到低濃度的GM-CSF，其中第二代BMSCs的細胞蛋白中GM-CSF濃度明顯高于

7、其他代(P<0.01)，其余幾代BMSCs的培養(yǎng)液和細胞蛋白中GM-CSF濃度無顯著差別(P>0.05)。Westem blot和RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)BMSCs上存在豐富的GM-CSFR表達，各代BMSCs之間GM-CSFR表達水平無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs可分泌少量的GM-CSF，并有豐富的GM-CSFR表達。 第二章：外源性GM-CSF促進大鼠骨髓基質(zhì)細胞體外誘導分化為神經(jīng)細胞

8、 目的：探索GM-CSF對BMSCs體外分化為神經(jīng)細胞的誘導作用及其分子機制。 方法：培養(yǎng)和鑒定SD大鼠BMSCs，取第五代BMSCs采用外源性GM-CSF進行分化誘導。分別于誘導后0h、6h、12h、24h、48h及96h行形態(tài)學觀察，同時采用免疫細胞化學及RT-PCR等方法觀察BMSCs體外是否表達神經(jīng)細胞特異性抗原標志巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neurone specific enolase，NS

9、E)和膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。為了進一步探討B(tài)MSCs誘導分化的分子機制，在上述時間點采用Westem blot方法檢測BMSCs中p-CREB/CREB的表達。使用大鼠成纖維細胞作為陰性對照組。 結(jié)果：與未誘導的BMSCs相比，外源性GM-CSF可誘導BMSCs體外橫向分化為突觸明確的神經(jīng)細胞，出現(xiàn)神經(jīng)細胞的形態(tài)特點，誘導后細胞表達神經(jīng)細胞特異性抗原標

10、志Nestin、NSE、GFAP。而陰性對照組的大鼠成纖維細胞形態(tài)在同樣誘導條件下則無明顯改變。Western blot發(fā)現(xiàn)給予GM-CSF誘導后6h，BMSCs中p-CREB水平開始增高，12h達到高峰，而CREB水平在誘導前后無顯著性改變。 結(jié)論：外源性GM-CSF可通過上調(diào)CREB磷酸化水平來誘導BMSCs向神經(jīng)細胞分化。 第三章：Lipofectamine介導的pUMVC1-mGM-CSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細胞

11、的實驗研究 目的：觀察脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs的轉(zhuǎn)染效率及外源基因的表達。 方法：培養(yǎng)和鑒定BMSCs；采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>2000將pUMVC1-mGM-CSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的BMSCs；相同條件下將攜帶綠色熒光蛋白基因的gWiz<'TM>GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs；分別于轉(zhuǎn)染后0h、6h、12h、24h、48h、96h及7d在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白基因的表

12、達來計算基因轉(zhuǎn)染效率，并按上述時間點應用RT-PCR和ELISA方法分別從mRNA和蛋白水平測定外源基因的表達。 結(jié)果：熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后6h細胞開始表達綠色熒光蛋白，至48h表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)量最多，熒光強度最亮，基因轉(zhuǎn)染效率可達40％。RT-PCR和ELISA檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后6h BMSCs開始出現(xiàn)mGM-CSF mRNA和蛋白表達，以后逐漸增強至48h最強，到轉(zhuǎn)染后第7d還有較強的表達。 結(jié)論：B

13、MSCs易于接受外源基因并表達；陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>2000介導的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs是較好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，該方法基因轉(zhuǎn)染效率高，外源基因表達時間長。 第四章：mGM-CSF基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細胞治療缺血性腦血管病 目的：探討GM-CSF基因修飾的BMSCs在大鼠腦梗死周邊區(qū)域局部存活、分化及對神經(jīng)功能的影響；明確同種異體BMSCs及GM-CSF基因轉(zhuǎn)染的BMSCs移植治療腦梗死的可行性及效果。

14、 方法：健康成年雄性SD大鼠135只隨機分為假手術(shù)組30只和手術(shù)組105只，手術(shù)組又隨機分為單純注射培養(yǎng)基ct-MEM組、BMSCs治療組及GM-CSF基因修飾的BMSCs治療組。均用線栓法制作短暫性MCAO模型。假手術(shù)組除不插線外其余步驟同MCAO模型。分離、鑒定SD大鼠BMSCs，取第三代BMSCs進行GM-CSF基因轉(zhuǎn)染。于MCAO 24h后采用立體定位儀分別將α-MEM培養(yǎng)基、BMSCs和GM-CSF基因修飾的BMSCs

15、植入到SD大鼠缺血腦組織周邊區(qū)域，移植后第3天、7天和21天行神經(jīng)功能評分，TTC染色法計算梗死體積，同時觀察植入細胞在局部存活、分化情況，HE染色和TUNEL原位標記法定量觀察缺血損傷周邊區(qū)域凋亡神經(jīng)細胞數(shù)目，免疫組化法觀察缺血損傷周邊區(qū)域微血管密度及海馬區(qū)域原位干細胞的增殖。 結(jié)果：異體大鼠BMSCs可在缺血腦組織周邊區(qū)域定居、生存并分化為神經(jīng)細胞。移植后第3天各組之間神經(jīng)功能評分無顯著性差異(P>0.05)。移植后第7天和

16、21天，與α-MEM組和BMSCs組相比，GM-CSF-BMSCs治療組神經(jīng)功能評分明顯降低(分別P<0.01，P<0.05)，梗死體積顯著縮小(分別P<0.01，P<0.05)，梗死周邊區(qū)域凋亡細胞數(shù)目明顯減少(分別P<0.01，P<0.05)而微血管密度明顯增多(均P<0.05)，海馬區(qū)原位干細胞的增殖顯著增多(分別P<0.001，P<0.05)。 結(jié)論：同種異體GM-CSF基因修飾BMSCs移植治療腦梗死可行，明顯優(yōu)越于單