表達(dá)豬GM-CSF重組PRRSV弱毒疫苗株的構(gòu)建及其免疫特性分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），是引起母豬繁殖障礙和仔豬出現(xiàn)呼吸道疾病的重要病原。該病毒感染后，能夠破壞免疫細(xì)胞，延遲宿主產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，造成免疫抑制，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，是一種具有多項(xiàng)潛能的造血生長因子，能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分化和成熟，進(jìn)而增強(qiáng)其抗原遞呈能力。為提高我國目前

2、現(xiàn)有高致病性PRRSV弱毒疫苗的免疫效果，本研究在高致病性PRRSV(HP-PRRSV)弱毒疫苗株HuN4-F112感染性分子克隆的基礎(chǔ)上，利用融合PCR的方法，將豬源GM-CSF基因序列，引入到弱毒疫苗株HuN4-F112基因組ORF1b和ORF2a之間，最終獲得了表達(dá)GM-CSF的重組PRRSV，并在體內(nèi)外進(jìn)行了重組病毒的生物學(xué)特性分析。
　　在試驗(yàn)中，首先構(gòu)建了重組表達(dá)載體pHuN4-F112-GM-CSF;為確保GM-CS

3、F基因在PRRSV中的遺傳穩(wěn)定性，我們?cè)贕M-CSF基因后插入PRRSV ORF6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(TRS6)，構(gòu)建了pHuN4-F112-GM-CSF-TRS6全長cDNA克隆;為引入缺失標(biāo)記基因，在PRRSV的Nsp2的復(fù)制非必需區(qū)刪除了110aa(480-620aa)，構(gòu)建了 pHuN4-F112-△110-GM-CSF和pHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6兩個(gè)全長cDNA克隆。利用SwaⅠ限制性內(nèi)切酶，分別將上述

4、四株全長cDNA克隆線性化，再通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒RNA，用脂質(zhì)體法將病毒RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，在MARC-145細(xì)胞中進(jìn)行病毒拯救、傳代和鑒定。對(duì)拯救的重組病毒進(jìn)行CPE觀察、RT-PCR擴(kuò)增、DNA測序、分子標(biāo)記MluⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示:四株重組病毒能夠在MARC-145細(xì)胞中成功救獲，且四株重組病毒在感染MARC-145細(xì)胞后，第一代即可引起明顯的細(xì)胞病變，并將其分別命名為rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6、rH

5、uN4-F112-GM-CSF、rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF。對(duì)救獲的四株重組病毒，在MARC-145細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)傳代和鑒定，測序結(jié)果顯示:含有TRS6的兩株重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6，在連續(xù)傳代20代過程中，引入的GM-CSF基因均未發(fā)生缺失、突變、插入等現(xiàn)象;同時(shí)通過間接免疫熒光

6、鑒定，這兩株各代次的重組病毒，均能表達(dá)GM-CSF，顯示良好的遺傳穩(wěn)定性。而不含TRS6的兩株重組病毒，其中rHuN4-F112-GM-CSF在傳至第3代時(shí)出現(xiàn)了GM-CSF基因插入突變現(xiàn)象，而rHuN4-F112-△110-GM-CSF在傳至第8代時(shí)出現(xiàn)了GM-CSF基因突變現(xiàn)象，對(duì)兩株穩(wěn)定遺傳的重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6進(jìn)行多步生長曲線繪制和噬斑形態(tài)分

7、析，結(jié)果顯示:這兩株重組病毒的生物學(xué)特性與親本毒HuN4-F112特性基本一致，表明獲得的這兩株表達(dá)豬源GM-CSF的重組病毒并不影響PRRS病毒的復(fù)制，推測在基因組中引入TRS6對(duì)外源基因獲得穩(wěn)定遺傳和表達(dá)具有重要作用。
　　為進(jìn)一步檢驗(yàn)重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6和rHuN4-F112-△110-GM-CSF-TRS6表達(dá)的外源基因GM-CSF對(duì)樹突狀細(xì)胞能否發(fā)揮成熟和活化作用，我們進(jìn)行了體外骨髓細(xì)胞分

8、化和活化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，這兩株重組病毒刺激骨髓源樹突狀細(xì)胞后，樹突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)水平顯著高于親本毒，說明重組病毒表達(dá)的GM-CSF能夠刺激樹突狀細(xì)胞進(jìn)行分化和成熟，而且兩株重組病毒之間活化樹突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。為進(jìn)一步探明重組病毒對(duì)TH1和TH2型細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，我們有針對(duì)性的選擇了重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6來作用骨髓細(xì)胞，通過qRT-PCR和Multiplex Immunoassay

9、s方法，來檢測骨髓源樹突狀細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)量，結(jié)果顯示:重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6刺激樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，IL-12和IL-1β在24h-96h之間一直呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且顯著高于親本毒組(p＜0.01);IFN-γ和IL-4在96h時(shí)也顯著高于親本毒組(p＜0.01)。說明重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6作用樹突狀細(xì)胞分化后，不僅能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞表達(dá)其特異性細(xì)胞因子IL-12

10、，而且能提高IL-1β、IFN-γ和IL-4等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，進(jìn)而對(duì)機(jī)體TH1型和TH2型細(xì)胞免疫反應(yīng)起到促進(jìn)作用。
　　為進(jìn)一步研究重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6在機(jī)體內(nèi)的免疫特性，我們把36頭健康仔豬隨機(jī)分為三組（每組12頭），即重組病毒rHuN4-F112-GM-CSF-TRS6免疫組、親本疫苗毒組和空白對(duì)照組，每組分別在免疫后3、7、14、21天時(shí)各剖殺3頭，采集外周血，分別進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、抗體和

11、病毒載量等檢測。結(jié)果顯示:重組病毒與親本毒免疫動(dòng)物后，病毒在試驗(yàn)豬體內(nèi)病毒載量變化趨勢基本相似。在免疫后14天，重組病毒組PRRSV抗體水平顯著高于親本毒組(P＜0.05)，重組病毒組CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞的活化比例也顯著高于親本疫苗免疫組(p＜0.05)。這初步說明，表達(dá)GM-CSF的重組病毒免疫動(dòng)物后，能夠提高機(jī)體T細(xì)胞的活化水平，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。本研究結(jié)果為提高PRRSV疫苗的免疫效果和新型疫苗的研制提供了