IBD VP2 DNA疫苗及雞Akirin2和GM-CSF對其免疫調節(jié)效果的研究.pdf

1、Akirins是天然免疫信號通路TLR所必須的核蛋白，調控依賴NF-κB的基因轉錄，在免疫和炎癥反應中不可或缺，是極具潛力的免疫增強基因。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）是新一代分子免疫佐劑，能活化樹突狀細胞，增強其抗原遞呈能力，提高機體免疫應答水平。傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease vir

2、us，IBDV）VP2基因編碼病原的主要結構和抗原蛋白VP2，是研制IBD DNA疫苗的重要靶基因。本試驗優(yōu)化合成了雞（Gallus）Akirin2和GM-CSF基因，研究了它們對IBD VP2 DNA疫苗的免疫調節(jié)效應，具有重要的學術價值和應用前景，主要研究內容包括：
　　1.參照GeneBank已發(fā)表的IBDV VP2（AF508177）、Gallus Akirin2（NM_001193595）和Gallus GM-CSF（E

3、U939770.1）基因序列，優(yōu)化合成三者編碼區(qū)核苷酸序列，利用連接肽串聯(lián)后克隆至 pTriEx-4，構建 VP2、Akirin2和 GM-CSF三表達重組質粒pVP2-Akirin2-GM-CSF。體外轉染293T細胞進行瞬時表達，48 h后通過SDS-PAGE和Western blot技術可檢測到目的蛋白的表達，大小分別為58 kDa、36kDa和22 kDa左右，證明該重組質?？梢杂米鱀NA疫苗免疫。試驗中同時成功構建五種對照重組

4、質粒：pVP2、pAkirin2、pGM-CSF、pVP2-Akirin2和pVP2-GM-CSF。
　　2.將pVP2重組質粒作為轉移載體與BacMagic-3 DNA構建重組桿狀病毒Bac-VP2，感染Sf9細胞后以IBD標準陽性血清作為一抗進行間接免疫熒光試驗，能夠檢測到特異性熒光。大量提取蛋白并經鎳柱親和層析，作為抗原包被酶標板制備VP2抗體ELISA檢測方法，經IBD標準血清檢測，證明其靈敏性、重復性良好；經雞馬立克（M

5、D）、禽白血病（AL）、禽網(wǎng)狀內皮組織增生癥（RE）、禽流感（AI）、雞新城疫（ND）陽性血清檢測，證明其特異性良好。
　　3.將pVP2-Akirin2-GM-CSF重組質粒作為DNA疫苗免疫14日齡SPF雞，28日齡加強免疫，42日齡以IBDV BC6-85強毒株攻擊，攻毒96 h后剖檢，統(tǒng)計得疫苗保護率為85％，高于pVP2組（55%）、pVP2-Akirin2組（75%）和pVP2-GM-CSF組（70%）。分別于14日齡

6、、28日齡、42日齡和46日齡翅下靜脈采血檢測血清VP2抗體和中和抗體水平。結果顯示，隨著免疫次數(shù)和時間的增加，pVP2-Akirin2-GM-CSF組VP2抗體水平和中和抗體滴度均持續(xù)上升，42日齡時，VP2抗體水平（S/P）值達到1.016，均高于pVP2組（S/P=0.771，p＜0.01)、pVP2-Akirin2組（S/P=0.973，p＞0.05)和pVP2-GM-CSF組（S/P=0.836，p＜0.01)；IBDV中和抗

7、體滴度達到1:4298，極顯著高于 pVP2組（1:2057，p＜0.01）、pVP2-Akirin2組（1:3514，p＜0.01）和pVP2-GM-CSF組（1:2557，p＜0.01)。MTT法檢測42日齡時外周血淋巴細胞增殖能力，pVP2-Akirin2-GM-CSF誘導的增殖指數(shù)均顯著高于其余各重組質粒組（p＜0.05)。ELISA檢測42日齡pVP2-Akirin2-GM-CSF組試驗雞血清IFN-γ、IL-2、IL-4和I