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文檔簡(jiǎn)介
1、目的
本課題以人白細(xì)胞介素-4(白介素-4,Interleukin-4,IL-4),粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)為模型細(xì)胞因子,建立并優(yōu)化人源性細(xì)胞因子的組合,并在真核細(xì)胞中穩(wěn)定性表達(dá)重組蛋白及其活性研究,這為多細(xì)胞因子在體外能夠共同表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)素材和理論參考。構(gòu)建人GM-CSF、IL-4基因各自獨(dú)立和經(jīng)IRES
2、元件串聯(lián)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、plL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4,轉(zhuǎn)染細(xì)胞并經(jīng)過連接免疫熒光(indirectimmunofluorescence assay,IFA)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)檢測(cè)其表達(dá)活性,為構(gòu)建永久表達(dá)細(xì)胞系做準(zhǔn)備,同時(shí)人源細(xì)胞因子的體外表達(dá)及其誘生DC/CIK培養(yǎng)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
方法
1
3、.引物和質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與合成
依據(jù)GenBank上已經(jīng)公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的參考序列。分別設(shè)計(jì)了附加酶切位點(diǎn)的引物,酶切位點(diǎn)為XhoⅠ、BglⅡ和SalⅠ、MluⅠ,以及質(zhì)粒pMD15-T-CSF、 pMD15-T-IL-4。
2.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建
經(jīng)PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4中的目的片段GM
4、-CSF、IL-4;利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收、瓊脂糖凝膠回收純化好的的PCR產(chǎn)物,分別在各自的酶切位點(diǎn)處進(jìn)行雙酶切,目的是回收兩條目的基因片段GM-CSF和IL-4;用T4連接酶分別與經(jīng)同步酶切的載體片段psT-△SG上進(jìn)行連接,經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的優(yōu)勢(shì)抗性菌落的常規(guī)篩選,構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)GM-CSF、IL-4基因的重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4;將目的基因與連接片段IRES分步連接到PsT-△SG載體上,經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長(zhǎng)
5、出的優(yōu)勢(shì)抗性菌落的常規(guī)篩選,構(gòu)建pGM-CSF-IRES-IL-4真核表達(dá)載體。
3.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在CHO細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
將重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4在陽性脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,24小時(shí)后檢測(cè)GM-CSF、IL-4在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。
4.IFA及Elisa檢測(cè)表達(dá)情況
對(duì)轉(zhuǎn)染的CH
6、O細(xì)胞用IFA和Elisa檢測(cè)人源GM-CSF、IL-4基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
結(jié)果
1.真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建
成功構(gòu)建的三種真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4,分別在經(jīng)菌落PCR,質(zhì)粒的PCR,瓊脂糖凝膠電泳雙酶切等方法鑒定后構(gòu)建成功。
2.IFA實(shí)驗(yàn)及Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GM-CSF、IL-4表達(dá)結(jié)果
7、
經(jīng)過IFA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出,在熒光顯微鏡的下陽性表達(dá)的細(xì)胞大約在60%以上左右。Elisa的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GM-CSF、IL-4兩種基因在培養(yǎng)的CHO細(xì)胞當(dāng)中能夠成功的表達(dá)。
結(jié)論
1.成功將人源基因GM-CSF、IL-4亞克隆入psT-△SG,分別構(gòu)建了融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4以及pGM-CSF-IRES-IL-4
2.人源細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4在真核細(xì)胞中表達(dá)并
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