人源GM-CSF、Il-4基因串聯(lián)共表達(dá)重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、目的
　　本課題以人白細(xì)胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4，IL-4），粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)為模型細(xì)胞因子，建立并優(yōu)化人源性細(xì)胞因子的組合，并在真核細(xì)胞中穩(wěn)定性表達(dá)重組蛋白及其活性研究，這為多細(xì)胞因子在體外能夠共同表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)素材和理論參考。構(gòu)建人GM-CSF、IL-4基因各自獨(dú)立和經(jīng)IRES

2、元件串聯(lián)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、plL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并經(jīng)過連接免疫熒光(indirectimmunofluorescence assay，IFA)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)檢測(cè)其表達(dá)活性，為構(gòu)建永久表達(dá)細(xì)胞系做準(zhǔn)備，同時(shí)人源細(xì)胞因子的體外表達(dá)及其誘生DC/CIK培養(yǎng)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　方法
　　1

3、.引物和質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與合成
　　依據(jù)GenBank上已經(jīng)公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的參考序列。分別設(shè)計(jì)了附加酶切位點(diǎn)的引物，酶切位點(diǎn)為XhoⅠ、BglⅡ和SalⅠ、MluⅠ，以及質(zhì)粒pMD15-T-CSF、 pMD15-T-IL-4。
　　2.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建
　　經(jīng)PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4中的目的片段GM

4、-CSF、IL-4;利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收、瓊脂糖凝膠回收純化好的的PCR產(chǎn)物，分別在各自的酶切位點(diǎn)處進(jìn)行雙酶切，目的是回收兩條目的基因片段GM-CSF和IL-4;用T4連接酶分別與經(jīng)同步酶切的載體片段psT-△SG上進(jìn)行連接，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的優(yōu)勢(shì)抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)GM-CSF、IL-4基因的重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4;將目的基因與連接片段IRES分步連接到PsT-△SG載體上，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長(zhǎng)

5、出的優(yōu)勢(shì)抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建pGM-CSF-IRES-IL-4真核表達(dá)載體。
　　3.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在CHO細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
　　將重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4在陽性脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)GM-CSF、IL-4在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。
　　4.IFA及Elisa檢測(cè)表達(dá)情況
　　對(duì)轉(zhuǎn)染的CH

6、O細(xì)胞用IFA和Elisa檢測(cè)人源GM-CSF、IL-4基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建
　　成功構(gòu)建的三種真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，分別在經(jīng)菌落PCR，質(zhì)粒的PCR，瓊脂糖凝膠電泳雙酶切等方法鑒定后構(gòu)建成功。
　　2.IFA實(shí)驗(yàn)及Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GM-CSF、IL-4表達(dá)結(jié)果

7、
　　經(jīng)過IFA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出，在熒光顯微鏡的下陽性表達(dá)的細(xì)胞大約在60％以上左右。Elisa的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GM-CSF、IL-4兩種基因在培養(yǎng)的CHO細(xì)胞當(dāng)中能夠成功的表達(dá)。
　　結(jié)論
　　1.成功將人源基因GM-CSF、IL-4亞克隆入psT-△SG，分別構(gòu)建了融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4以及pGM-CSF-IRES-IL-4
　　2.人源細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4在真核細(xì)胞中表達(dá)并