巨噬細(xì)胞及GM-CSF對大鼠DIEP皮瓣成活影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腹壁下動脈穿支(DIEP)皮瓣作為穿支皮瓣的代表，在最近的十幾年中得到了廣泛的臨床應(yīng)用。目前，DIEP皮瓣已經(jīng)超過TRAM皮瓣成為自體組織乳房再造的首選術(shù)式。DIEP皮瓣再造乳房的優(yōu)點(diǎn)是擁有充足的組織量，腹壁皮膚的色澤、質(zhì)地與受區(qū)十分相似，再造的乳房外觀、顏色與手感均較滿意；皮瓣血管蒂較長，十分有利于皮瓣塑形，且腹壁下動脈的口徑與胸廓內(nèi)動脈及胸背動脈的口徑相當(dāng)，利于血管吻合；DIEP皮瓣乳房再造的最大優(yōu)勢體現(xiàn)在供區(qū)的并發(fā)癥發(fā)生率下降，該

2、技術(shù)保留了腹直肌前鞘及大部分腹直肌，減少了術(shù)后腹壁疼痛、薄弱、腹壁膨出和腹壁疝的發(fā)生率，最大程度地保護(hù)了供區(qū)，使患者獲得外形美觀效果的同時保留了供區(qū)的功能，此外手術(shù)恢復(fù)時間亦縮短。但DIEP皮瓣乳房再造仍然存在并發(fā)癥，人們享有其優(yōu)勢的代價(jià)是不僅增加了手術(shù)的復(fù)雜性，而且因?yàn)槿藶闇p少了腹直肌肌皮穿支的數(shù)量，從而減少了皮瓣的血供，理論上增加了皮瓣部分壞死和脂肪液化的幾率。如何提高乳房再造中DIEP皮瓣的成活率，是整形外科和腫瘤外科面臨的一道難

3、題。 當(dāng)前促進(jìn)皮瓣成活的研究聚集在以血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為代表的各種細(xì)胞因子的研究上。目前普遍認(rèn)為VEGF是一種最重要的血管生成因子，在治療性血管生成中具有重要意義。但是，以VEGF為代表的多種生長因子在病理性血管生成中同樣發(fā)揮著重要作用。腫瘤學(xué)研究表明VEGF是目前所知作用最強(qiáng)、選擇性最高的內(nèi)皮細(xì)胞絲裂原，是腫瘤血管生成中的重要調(diào)節(jié)因子，在許多實(shí)體腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中起著極為重要的作用。我們認(rèn)為，通過基因治療的方法將具有

4、潛在的促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的VGEF用于乳癌術(shù)后乳房再造的患者以促進(jìn)再造乳房皮瓣成活是不合適的。 重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)已應(yīng)用于臨床多年，是乳腺癌病人輔助化療時的常規(guī)用藥。在乳腺癌治療的臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)，因化療造成的白細(xì)胞低于正常的患者在接受rhGM-CSF治療后術(shù)區(qū)原本愈合不良的創(chuàng)面會很快愈合，所以我們設(shè)想是否單核/巨噬細(xì)胞抑或GM-CSF存在促進(jìn)皮瓣血管生成的作用?文獻(xiàn)顯示：近幾年研究GM-CS

5、F促進(jìn)創(chuàng)面愈合的報(bào)道比較多，而且絕大部分獲得了積極的結(jié)果。但將GM-CSF直接應(yīng)用于皮瓣，觀察其對皮瓣成活影響的研究很少。因此我們將GM-CSF及過繼巨噬細(xì)胞用于乳房再造常規(guī)應(yīng)用的DIEP皮瓣模型中，研究其對皮瓣成活的影響，具有特殊的臨床意義。 本實(shí)驗(yàn)的第一部分研究了大鼠腹部皮瓣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并改進(jìn)了rat-DIEP皮瓣的制作過程，不解剖腹直肌，僅在腹直肌前鞘層面選擇穿支血管并切斷其它血供，形成DIEP皮瓣，在手術(shù)時間縮短的同時，

6、使模型具有更好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。第一部分實(shí)驗(yàn)中我們成功建立了穩(wěn)定的rat-DIEP模型，并形成了相對簡單、容易推廣的操作流程。使rat-DIEP可以作為常規(guī)模型進(jìn)行皮瓣成活的實(shí)驗(yàn)研究。模型形成后，我們通過大體觀察及HE染色后的組織學(xué)檢查記錄了皮瓣成活的進(jìn)程。通過免疫組化以VWF作為血管內(nèi)皮的識別標(biāo)志，檢測皮瓣各個時點(diǎn)的微血管密度(MVD)的變化，應(yīng)用苦味酸天狼猩紅染色及偏振光顯微圖像定量分析技術(shù)檢測皮瓣內(nèi)膠原含量，并描繪出在無干預(yù)情況

7、下rat-DIEP皮瓣形成過程中MVD及膠原含量與各時點(diǎn)之間的變化關(guān)系。 第二部分實(shí)驗(yàn)的目的是研究GM-CSF以及巨噬細(xì)胞(Mφ)對大鼠皮瓣成活的影響。我們應(yīng)用大鼠腹腔直接灌洗的方法，經(jīng)過分離、純化獲得大鼠Mφ。實(shí)驗(yàn)中將模型動物分為四組，分別于皮瓣皮下應(yīng)用重組大鼠GM-CSF，GM-CSF聯(lián)合過繼大鼠Mφ，過繼大鼠Mφ及生理鹽水。術(shù)后第7天取皮瓣標(biāo)本，進(jìn)行皮瓣成活面積的測定，以及免疫組化MVD檢測，Masson染色檢測皮瓣組織內(nèi)

8、膠原含量?；罨腗φ可分泌100多種物質(zhì)，其中包括大量細(xì)胞因子，可直接誘導(dǎo)新生血管生長。從理論上來說，Mφ應(yīng)該具有促進(jìn)皮瓣成活的治療作用，但是，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過繼的Mφ沒有增加大鼠皮瓣的成活比率。在皮瓣內(nèi)MVD檢測中，單純應(yīng)用Mφ干預(yù)皮瓣成活的T組皮瓣MVD高于對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在皮瓣膠原含量檢測中我們發(fā)現(xiàn)，單純應(yīng)用Mφ干預(yù)組膠原含量明顯低于對照組(p<0.05)，這可能因?yàn)镸φ過量激活金屬蛋白酶導(dǎo)致膠原分解過程延長的結(jié)果。與

9、其相反，應(yīng)用GM-CSF組及其聯(lián)合應(yīng)用Mφ組皮瓣成活率高于對照組(p<0.05)，其皮瓣MVD和膠原含量均明顯高于對照組(p<0.001)。 第二部分實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論是：重組大鼠GM-CSF及其聯(lián)合過繼的大鼠Mφ皮下注射能夠提高大鼠DIEP皮瓣的成活率；并且能夠明顯提高術(shù)后第7天大鼠DIEP皮瓣的MVD及膠原含量。過繼大鼠Mφ單獨(dú)應(yīng)用不能明顯提高大鼠DIEP皮瓣的成活率。 第三部分實(shí)驗(yàn)的目的是探討重組大鼠GM-CSF及其與

10、過繼大鼠Mφ聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)大鼠DIEP皮瓣成活的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用RT-PCR技術(shù)檢測第二部分實(shí)驗(yàn)中各組動物皮瓣內(nèi)的多項(xiàng)基因表達(dá)，包括EMMPRIN、MMP2、TIMP1、Collagen I、Collagenlll、EGF、TGF—β1、VEGF、EGFR及VEGFR等。比較它們在各組皮瓣中的表達(dá)情況，從基因水平探討GM-CSF及其聯(lián)合Mφ促進(jìn)皮瓣成活的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用GM-CSF組皮瓣EMMPRIN、MMP2、Col

11、lagen I、EGF和EGFR基因表達(dá)高于對照組；聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF+Mφ組皮瓣EMMPRIN、MMP2、TIMP1、Collagen I、CollagenlII、EGF、TGF-β1和EGFR基因表達(dá)高于對照組；應(yīng)用Mφ組皮瓣EMMPRIN、MMP2、TGF-β1和EGF基因表達(dá)高于對照組。這些基因的上調(diào)從分子水平解釋了實(shí)驗(yàn)組大鼠皮瓣成活率提高的原因。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)論認(rèn)為大鼠DIEP模型是一個穩(wěn)定可靠的皮瓣研究