超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的搭建及其在中藥藥性判別中的應(yīng)用.pdf

1、中藥藥性的客觀化判別和評(píng)價(jià)是制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一，也是中醫(yī)藥研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。中藥藥性是藥物與治療相關(guān)的性質(zhì)和效能，它用極其精煉的語(yǔ)言表述一味藥或者一類(lèi)藥的臨床效用，概括臨床效用的范圍、屬性和特征，是溝通理論和臨床實(shí)踐的橋梁和紐帶。但是傳統(tǒng)中藥藥性理論在其形成、發(fā)展和應(yīng)用的過(guò)程中，由于受當(dāng)時(shí)對(duì)自然界的認(rèn)識(shí)水平所限，對(duì)藥性的認(rèn)知主要來(lái)源于經(jīng)驗(yàn)的積累，表述存在模糊性和主觀性，這使中藥在臨床應(yīng)用過(guò)程中缺少可供參考的客觀化、定量化的

2、指標(biāo)，影響中藥的安全性和有效性。如何揭示中藥藥性的科學(xué)內(nèi)涵，實(shí)現(xiàn)中藥藥性的定量化和客觀化，成為中藥研究亟待解決的問(wèn)題。
　　中藥材所含物質(zhì)成分復(fù)雜，要把中藥藥性研究建立在藥效清晰的每個(gè)化學(xué)成分的基礎(chǔ)上是相當(dāng)困難的，這就需要在尚不清楚全體化學(xué)成分的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)整體的評(píng)價(jià)，而目前的理化鑒定很難實(shí)現(xiàn)，要想取得質(zhì)的突破則必須另尋它路。超微弱發(fā)光(Ultra Weak Luminescence，UWL)是自然界一個(gè)普遍的生命現(xiàn)象，廣泛存在

3、于動(dòng)物、植物及微生物等各種生物系統(tǒng)之中，是生物體固有的一種功能。超微弱發(fā)光來(lái)源于生物分子從高能態(tài)到低能態(tài)的躍遷，對(duì)生物系統(tǒng)外界環(huán)境影響和內(nèi)部變化有高度的敏感性，并與生物系統(tǒng)的光合作用、氧化代謝、信息傳遞、細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等重要生命活動(dòng)關(guān)系密切，因此通過(guò)對(duì)超微弱發(fā)光的探測(cè)和分析能夠獲得生物系統(tǒng)內(nèi)部的整體信息。超微弱發(fā)光強(qiáng)度極其微弱，超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的搭建可以為超微弱發(fā)光檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)條件，該系統(tǒng)具有無(wú)侵入性、靈敏度高、快速、可靠的優(yōu)

4、點(diǎn)，能夠?yàn)樯锵到y(tǒng)提供一個(gè)反映整體信息的綜合指標(biāo)。超微弱發(fā)光是從整體上反映生物系統(tǒng)內(nèi)部信息，且生物光子探測(cè)系統(tǒng)在探測(cè)的過(guò)程中對(duì)樣本無(wú)任何破壞，保證了樣本的原有性質(zhì)不變。目前超微弱發(fā)光已經(jīng)在植物種子、腫瘤細(xì)胞的分類(lèi)和鑒別中展開(kāi)了廣泛的研究，但是在中藥材的分類(lèi)鑒別，尤其是中藥藥性的鑒別中尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文擬通過(guò)建立超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，來(lái)探索一種能夠真正反映中藥藥性的評(píng)價(jià)新方法和新模式，這對(duì)于揭示中藥藥性的科學(xué)內(nèi)涵，實(shí)現(xiàn)中藥藥性的定量化和客

5、觀化，具有重大意義。
　　主要研究?jī)?nèi)容:
　　第一部分 超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的搭建
　　超微弱發(fā)光強(qiáng)度極其微弱，用一般的檢測(cè)方法很難檢測(cè)到，所以必須采用靈敏度高和背景噪聲低的光電探測(cè)儀器才能進(jìn)行有效的探測(cè)。課題組在充分借鑒其它儀器系統(tǒng)和公司開(kāi)發(fā)的相關(guān)類(lèi)似檢測(cè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合本課題的研究特點(diǎn)，聯(lián)合荷蘭Meluna R.V公司共同研發(fā)搭建了超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)。
　　搭建的超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)采用高靈敏度的端窗性光電倍增

6、管，增加了探測(cè)表面積，提高了探測(cè)效率。設(shè)計(jì)上模塊化和自動(dòng)化的特點(diǎn)為儀器系統(tǒng)的維護(hù)和使用提供了便利，減少了人為干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。系統(tǒng)的暗室設(shè)計(jì)既有利于樣品的放置和檢測(cè)，通過(guò)開(kāi)關(guān)的特殊設(shè)計(jì)減少了外界光線的影響。對(duì)系統(tǒng)整體進(jìn)行電磁屏蔽設(shè)計(jì)，外部電源采用專業(yè)濾波器電源，減少外部電磁信號(hào)及電流波動(dòng)對(duì)超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的干擾。濾光片系統(tǒng)采用高透光率長(zhǎng)通濾光片，其由于磷光現(xiàn)象導(dǎo)致的背景噪聲除GG395達(dá)77CPS和GG455達(dá)22CPS以外，其余

7、濾光片均低于15CPS，相較于樣品光強(qiáng)可忽略不計(jì)，同時(shí)濾光片系統(tǒng)為中藥材延遲發(fā)光光譜分布檢測(cè)提供了技術(shù)支持。
　　最終通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在光電倍增管制冷至零下22-25℃的條件下，本課題搭建的超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)在“Background”模式下的背景噪聲為10CPS左右;在“SE measurement”模式下的背景噪聲在15CPS左右，其儀器的高信噪比為干燥中藥材的超微弱發(fā)光檢測(cè)提供了條件。
　　第二部 分延遲發(fā)光與中藥藥性的相

8、關(guān)性
　　第一，基于搭建的超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，探討干燥中藥材粉末延遲發(fā)光的影響因素，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立中藥材延遲發(fā)光實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的激發(fā)光源，樣品的含水量，樣品的顆粒大小對(duì)延遲發(fā)光有著明顯的影響。為了使后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性，我們將實(shí)驗(yàn)條件確定為:室溫22℃，RH50％;光電倍增管制冷時(shí)間2小時(shí)，制冷最低恒定溫度為零下20-23℃;盛放中藥樣品的平皿直徑5cm，5g中藥樣品平鋪在平皿底部;激發(fā)光源為白光，激發(fā)時(shí)間為10

9、s;樣品顆粒大小用中藥篩篩選80-120目大小顆粒;樣品含水量控制方式為干燥器中連續(xù)干燥16h;計(jì)數(shù)間隔時(shí)間為1s，計(jì)數(shù)量為200個(gè)，連續(xù)重復(fù)測(cè)量3次。
　　第二，選取《中國(guó)藥典》2010版中根類(lèi)及根莖類(lèi)中藥，基于搭建的超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)中藥材粉末樣品，獲取不同中藥藥性樣品的延遲發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)合雙曲線數(shù)學(xué)模型及統(tǒng)計(jì)熵?cái)?shù)學(xué)模型，推導(dǎo)平均光子數(shù)和相干時(shí)間數(shù)學(xué)模型，通過(guò)數(shù)據(jù)擬合分析，獲得表征延遲發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線的的參數(shù)，其中I0

10、反映的是延遲發(fā)光的初始強(qiáng)度，其與樣品本身的性質(zhì)相關(guān);β是一個(gè)指數(shù)因子，它與曲線弛豫衰減的速率相關(guān);τ是一個(gè)特征時(shí)間，與樣品的性質(zhì)相關(guān);N表示的平均光子數(shù);T表示的是特征時(shí)間;S是統(tǒng)計(jì)熵樣品的整體有序性相關(guān)。
　　第三，基于獲得的中藥樣品延遲發(fā)光動(dòng)力學(xué)參數(shù)，通過(guò)聚類(lèi)分析將選取的中藥分組，通過(guò)比較聚類(lèi)分析分組與中藥藥性藥效之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)延遲發(fā)光參數(shù)的聚類(lèi)分析結(jié)果與基于《中國(guó)藥典》2010版的中藥寒熱藥性存在較高一致性，驗(yàn)證延遲發(fā)光可

11、能與中藥寒熱藥性存在相關(guān)性。
　　第三部分 不同藥性中藥材的光譜分析
　　第一在本章中，我們利用光譜儀檢測(cè)所采用濾光片的技術(shù)性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所有濾光片的光透過(guò)率均在88％-90％之間，具有較高的透光率，可用于超微弱發(fā)光的檢測(cè)。
　　第二在上一章節(jié)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，利用搭建的超微弱發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)及長(zhǎng)通濾光片系統(tǒng)對(duì)中藥材延遲發(fā)光的光譜分布進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行衰減概率分布整理分析，結(jié)果顯示不同寒熱藥性分組的中藥材的延遲發(fā)光衰

12、減概率分布函數(shù)的Pmax和γmax存在顯著性差異。
　　第三通過(guò)對(duì)不同寒熱藥性分組的中藥材的光譜分布比值的分析，我們也發(fā)現(xiàn)在小于610nm范圍內(nèi)的光譜分布比值中，寒性中藥組高于熱性中藥組，而大于610nm光譜范圍的光譜分布比值中，熱性中藥組高于寒性中藥組。從光譜分布的角度驗(yàn)證了寒熱藥性中藥的客觀差異。
　　第四部分 基于延遲發(fā)光的中藥寒熱藥性判別方法
　　第一在前期研究的基礎(chǔ)上，選取153種寒熱藥性的中藥材作為研究對(duì)象

13、，按照隨機(jī)原則分為實(shí)驗(yàn)組和驗(yàn)證組。首先對(duì)實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)其延遲發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，通過(guò)數(shù)據(jù)擬合及計(jì)算分析，獲得反映延遲發(fā)光曲線性質(zhì)的參數(shù)分別為初始強(qiáng)度I0、衰減指數(shù)β、特征時(shí)間τ、平均光子數(shù)N、衰減時(shí)間T和統(tǒng)計(jì)熵S。隨后通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)分析這6個(gè)參數(shù)的相關(guān)性，將研究參數(shù)篩選為平均光子數(shù)N、衰減時(shí)間T和統(tǒng)計(jì)熵S。利用實(shí)驗(yàn)組篩選后的參數(shù)對(duì)進(jìn)行Logistic回歸分析，最終結(jié)果顯示平均光子數(shù)N和統(tǒng)計(jì)熵S與中藥藥性的判別存在相關(guān)性，可以作為探討

14、中藥藥性的判別指標(biāo)，并形成判別公式Y(jié)=1/1+e(-11.981+2.892*X1+0.270*X2)，（X1=統(tǒng)計(jì)熵S，X2=平均光子數(shù)N），其寒性中藥材的判別準(zhǔn)確率為83.1％，熱性中藥材的判別準(zhǔn)確率為75.6％，整體的判別準(zhǔn)確率為79.4％，整體判別的準(zhǔn)確性較高。
　　第二進(jìn)一步對(duì)訓(xùn)練組利用ROC曲線分析對(duì)判別參數(shù)的判別效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)logistic回歸分析獲得的參數(shù)統(tǒng)計(jì)熵S、平均光子數(shù)N，判別公式獲得的整

15、體參數(shù)Y的判別的準(zhǔn)確率分別為83.93％、80.36％、78.57％，判別參數(shù)的臨界閾值分別為3.95、3442.39、0.7914，具有較高的準(zhǔn)確性，可作為客觀化的中藥寒熱藥性判別指標(biāo)。
　　第五部分 結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
　　一、結(jié)論
　　1.驗(yàn)證了中藥寒熱藥性與中藥延遲發(fā)光之間存在相關(guān)性;證實(shí)延遲發(fā)光技術(shù)可以作為反映中藥藥性基本特征的綜合指標(biāo);建立了中藥材延遲發(fā)光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系。
　　2.建立基于中藥材延遲發(fā)光動(dòng)

16、力學(xué)參數(shù)的中藥寒熱藥性判別公式，為中藥藥性的客觀評(píng)價(jià)提供了統(tǒng)計(jì)墑S、平均光子數(shù)N兩個(gè)判別指標(biāo)和判別數(shù)學(xué)模型，獲得判別臨界閾值為3.95、3442.39、0.7914，判別的準(zhǔn)確率分別為83.93％、80.36％、78.57％。
　　一、創(chuàng)新點(diǎn)和不足
　　1.首次運(yùn)用既符合現(xiàn)代科技認(rèn)知的技術(shù)方法又與中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論整體觀相自恰的延遲發(fā)光技術(shù)探討中藥藥性，驗(yàn)證了中藥材延遲發(fā)光與中藥寒熱藥性之間存在相關(guān)性。但是由于缺少臨床研究，不能