microRNA-31對HIV感染T細胞活化的調控作用及機制研究.pdf

1、目的：人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染人體后會導致嚴重的細胞免疫損傷。T細胞是機體免疫系統(tǒng)充分發(fā)揮細胞免疫及免疫調節(jié)作用的主要成分，也是HIV感染中最重要的效應細胞，但是HIV感染使得T細胞免疫功能在感染早期就出現了功能障礙。與慢性免疫激活不同，T細胞的有效活化是T細胞增殖、分化，進一步發(fā)揮細胞免疫效應的基礎，對于HIV急性期/早期感染階段的有效活化受損研究較少且機制尚不明確。T細

2、胞的有效活化依賴于雙信號及細胞因子的共同作用，TCR與MHC復合結構特異性結合后，CD3將識別的抗原信息向細胞內傳導，啟動細胞的活化過程，最終T細胞分化為效應細胞發(fā)揮細胞免疫效應。其中T細胞有效活化的信號傳導通路主要包括Ras-mapk(mitogen-activated protein kinase)通路、IP3-Ga(Inositol Trisphosphate-Calcium)通路及PKC（Protein kinase C）通路，

3、信號傳導的最終結果是活化了某些蛋白分子，被活化的蛋白質在構型上發(fā)生變化，使其具備了轉錄因子的功能。AP-1(Activator protein1)、NFAT(Nuclear factor of activated T-cells)、NF-κB(NuclearFactor kappa B)分別是三條信號通路活化的轉錄因子，這些轉錄因子通過作用于某些特殊的基因，最終引起細胞功能的改變。CD69是T細胞最早期的活化標志，在靜息淋巴細胞上不表達

4、，并且CD69可以很好的預測T細胞的增殖、分化、分泌等功能，被認為是評價T細胞有效活化能力的最快速、最常用、最典型的指標。microRNA可以精確而有效地調控很多的生物進程，同樣也參與了T細胞免疫應答的調控，miR-155、miR-181c、miR-9均參與調控T細胞的活化反應，miRNA是否參與HIV感染早期有效免疫活化不清楚。HIV感染會影響microRNA的表達譜發(fā)生變化，實驗室前期研究發(fā)現HIV快速進展者感染早期miR-31明顯

5、低表達，過表達miR-31可以上調CD4+T細胞表面CD69(Cluster of Differentiation69)的表達。本課題探究了miR-31與HIV感染有效活化反應能力受損的關系以及miR-31對T細胞有效活化(CD69)的調控作用及作用機制，目前尚未見報道。研究結果顯示，HIV感染者T細胞有效活化反應能力受損與感染者中miR-31的低表達有關，并且miR-31可以調控Ras-MAPK(mitogen-activated p

6、rotein kinase)信號通路促進ERK1/2(Extracellular Signal-regulated Kinase-1/2)磷酸化來進一步促進T細胞的有效活化。而Ras-MAPK信號通路中的負調控因子KSR2(Kinasesuppressors of Ras2)和DUSP7（Dual-specificity phosphatases7）同時作為miR-31的靶基因在該病理反應中起負性調節(jié)作用。我們的研究為明確HIV感染的免

7、疫受損及機制提供了新的信息。
　　方法：⑴miRNA過表達及敲減。PBMCs(Peripheral blood mononuclear cells)及Jurkat細胞中miR-31的過表達應用Amaxa電轉儀轉染實驗組質粒GFP-pMax-miR-31及對照組質粒GFP-pMax-mock后置于37℃預溫的10％FBS(Fetal bovine serum)的1640培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后換液，培養(yǎng)至2

8、4h。293T細胞中miR-31的過表達應用miR-31特異性mimics類似物以2nmol為轉染終濃度，通過HiPerFect轉染試劑進行轉染，含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至24h。PBMCs及23T細胞miR-31的敲減均采用miR-31特異性抑制劑antagomir，以500nmol為轉染終濃度，用不含FBS的1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基孵育2h，后添加3倍體積的含10％FBS的1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至72h(

9、PBMCs)或24h(23T細胞)。⑵T細胞活化的流式細胞檢測術。收取前期處理細胞，PBS（Phosphate buffer saline）洗兩遍離心，棄凈上清，用含10％FBS的1640培養(yǎng)基重懸，于包被anti-CD3/anti-CD28(0.5 ug/ml)的96孔板中刺激24h。避光染色(7AAD-Percp、CD3-PE-CY7、CD4-FITC/PE、CD8-APC、CD69-APC-CY7/PE)30min，離心洗滌細胞，

10、用BD LSRⅡ流式細胞儀及BD FACSDiva TM軟件檢測并分析GFP+/CY3+的7-AAD-CD4+和7-AAD-CD8+T細胞表面CD69表達水平。⑶總RNA提取及逆轉錄。收取前期處理細胞，采用RNeasy Plus Mini Kit試劑盒（細胞數大于1×106個/ml）或RNeasy Micro Kit試劑盒（細胞數小于1×106個/ml），按照試劑盒說明書標準方法提取細胞總RNA。將純化收集的總RNA立即用Primpsc

11、ript(@) RTreagent kit試劑盒進行反轉錄，反轉錄體系參照試劑盒說明書要求，將反轉錄后的cDNA于-20℃保存以便進行過表達或敲減miR-31后靶基因的檢測。⑷miRNA提取及逆轉錄。收取前期處理細胞，采用miRNeasy Mini Kit試劑盒（細胞數大于1×106個/ml）或miRNeasy Micro Kit試劑盒（細胞數小于1×106個/ml），按照試劑盒說明書標準方法提取細胞miRNA。將純化收集的miRNA立

12、即用Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit試劑盒進行反轉錄，反轉錄體系參照試劑盒說明書要求，將反轉錄后的cDNA于-20℃保存以便進行miR-31過表達或敲減水平的檢測。⑸熒光實時定量PCR。將反轉錄后的cDNA樣本，采用SYBR(@) Premix ExTaqTMⅡ試劑盒，定量體系參照試劑盒說明書要求，按照試劑盒說明書標準方法進行qRT-PCR檢測。GAPDH、U6分別作為總RNA定量和miRN

13、A定量的內參。⑹胞內蛋白磷酸化檢測。Jurkat細胞通過Amaxa電轉儀電轉完成miR-31的過表達，過表達24h后，收取細胞PBS清洗，離心棄上清。細胞重懸，室溫避光染色(violet-Live-dead)30min后，PBS清洗，離心棄上清，細胞用培養(yǎng)基重懸。將不同處理組分別置于96孔板中，anti-CD3&anti-CD28(2ug/ml)刺激15min、0min，加入等體積的預溫固定液，37度固定10min。收取細胞，4度洗液清

14、洗，離心棄上清。細胞重懸后，破膜劑冰上破膜30min，4度清洗，離心棄上清。避光4度染色(Alexa Fluor647-anti-ERK1/2，pT202/pY204)30min，4度清洗，離心棄上清后，細胞重懸，BD LSRⅡ流式細胞儀及BD FACSDiva TM軟件檢測并分析Live-dead-Jurkat細胞ERK1/2磷酸化水平。⑺統(tǒng)計學分析。用SPSS17.0統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學分析，相

15、關的兩組之間的比較用兩樣本的配對T檢驗或Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：①HIV感染者中miR-31低表達。結合前期miRNA-microarray的結果發(fā)現，與健康人相比，HIV感染者中miR-31的表達明顯減少(P=0.0018)。②miR-31調控T細胞的有效活化。鑒于miR-31的表達具有T細胞特異性，前期結果發(fā)現HIV感染者中miR-31低表達且T細胞有效活化反應能力受到損傷，我

16、們將進一步探究miR-31對T細胞有效活化能力的調控作用。miR-31過表達上調T細胞表面CD69的表達。健康人PBMCs電轉過表達miR-31后，實時定量檢測miR-31過表達水平，同時TCR刺激24后，流式檢測GFP+CD4+T細胞及GFP+CD8+T細胞表面CD69的表達。結果顯示，與對照組相比，CD4+T細胞中miR-31有效過表達后(P=0.0013)，CD4+T細胞表面CD69表達明顯上調(P=0.0022)，CD8+T細胞

17、中miR-31有效過表達后(P=0.3494)，CD8+T細胞表面CD69表達明顯上調(P=0.0170)。miR-31敲減下調T細胞表面CD69的表達。健康人PBMCs用antagomir敲減miR-31后，實時定量檢測miR-31敲減后水平，同時TCR刺激24后，流式檢測CY3+CD4+T細胞及CY3+CD8+T細胞表面CD69的表達。結果顯示，與對照組相比，CD4+T中miR-31有效敲減后(P=0.0084)，CD4+T細胞表面

18、CD69表達明顯下調(P=0.0020)，CD8+T中miR-31有效敲減后(P=0.0113)，CD8+T細胞表面CD69表達明顯下調(P=0.0397)。③miR-31靶向調控靶基因KSR2和DUSP7。通過生物信息學方法，DAVID軟件進行信號通路分析，最終確立了靶點評分較高且負調控T細胞活化的miR-31的靶基因RASA1、KSR2、PAQR3、DUSP7。通過在293T細胞中過表達miR-31，24h后實時定量PCR檢測miR

19、-31及靶基因mRNA水平，miR-31有效過表達10倍左右(P=0.0302)，靶基因KSR2、DUSP7mRNA水平明顯下調(P=0.0166，P=0.0439)，差異有統(tǒng)計學意義，靶基因RASA1、PAQR3 mRNA水平變化沒有統(tǒng)計學意義。進一步在293T細胞中敲減miR-31，24h后實時定量PCR檢測miR-31及靶基因mRNA水平，miR-31被有效敲減50％左右(P=0.0029)，靶基因KSR2、DUSP7 mRNA水

20、平明顯上調(P=0.0214，P=0.0296)，差異有統(tǒng)計學意義。④miR-31調控Ras-MAPK信號通路促進ERK1/2磷酸化。靶基因KSR2、DUSP7為Ras-MAPK信號通路中已知的負調控因子，我們將進一步探究miR-31是否通過調控該通路影響ERK1/2磷酸化來促進T細胞的有效活化。Jurkat細胞通過Amaxa電轉儀電轉完成miR-31的過表達，TCR刺激15min后，流式檢測并分析ERK1/2磷酸化水平。結果顯示，mi