玉米兩種尿卟啉原脫羧酶的基因克隆及其催化底物的酶促合成.pdf

1、尿卟啉原脫羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase，UROD）是植物葉綠素、血紅素和光敏色素的生色團(tuán)分支合成關(guān)鍵酶，催化尿卟啉原Ⅲ脫羧產(chǎn)生糞卟啉原Ⅲ。高等植物含兩種UROD。已發(fā)現(xiàn)UROD是氧化還原信號(hào)主要傳遞者硫氧還蛋白調(diào)節(jié)的靶蛋白，但是否調(diào)節(jié)兩種UROD尚不清楚。研究硫氧還蛋白調(diào)節(jié)UROD的分子機(jī)制，闡明植物四吡咯分子合成與氧化還原信號(hào)之間的關(guān)系，具有重要意義。UROD的底物尿卟啉原Ⅲ易分解，其上游中間物5

2、-氨基酮戊酸穩(wěn)定性好。本文利用大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)，研究了玉米兩種重組UROD的表達(dá)、純化和活性。具體結(jié)果如下：
　　 1．根據(jù)已公布的玉米編碼UROD的序列，使用Expasy server的ChloroP1.1軟件分析編碼玉米的兩種UROD的導(dǎo)肽序列，預(yù)測(cè)得出Arg25為UROD1第一個(gè)氨基酸殘基，Arg27為UROD2的第一個(gè)氨基酸殘基，運(yùn)用NEBcutter V2.0分析玉米兩種UROD所編碼的成熟蛋白的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，

3、設(shè)計(jì)引物。利用Trizol法提取玉米B73自交系幼葉總RNA，RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物約1kb，測(cè)序結(jié)果顯示UROD1編碼基因有5處突變，利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將突變位點(diǎn)恢復(fù)成野生型；UROD2編碼基因有1處突變，利用BLAST軟件序列比對(duì)表明突變編碼的氨基酸殘基和野生型相似。
　　 2．分別將兩種UROD插入表達(dá)載體pQE80，誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE未檢測(cè)到特異條帶。為提高UROD在大腸桿菌的可溶性表達(dá)水平，分別將UROD基因

4、插入不同表達(dá)載體，表達(dá)的UROD的N端分別含有Trx、GST、MBP和SUMO擔(dān)子蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后，仍然未檢測(cè)到明顯的特異條帶。
　　 3．根據(jù)已公布的大腸桿菌編碼5-氨基酮戊酸脫水酶的hemB基因，編碼膽色素原脫氨酶的hemC基因和編碼尿卟啉原Ⅲ合酶的hemD基因，設(shè)計(jì)引物，利用CTAB法提取大腸桿菌DH5a基因組DNA，PCR擴(kuò)增出特異片段，分別插入大腸桿菌表達(dá)載體，序列測(cè)定表明擴(kuò)增的基因產(chǎn)物和公布序列一致。3個(gè)重組蛋白N端