用慢病毒載體作為模型研究具有保護(hù)內(nèi)含子作用的元件.pdf

1、在I型獲得性免疫缺陷病毒（HIV-1）的生命周期中，病毒通過不同的剪接方式產(chǎn)生了40多種不同類型的mRNA,這些mRNA翻譯出的功能蛋白能將完整的轉(zhuǎn)錄本重新包裝成新的病毒。例如，Rev蛋白將完整長度的或是單一剪接的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)運出核。因此，必然存在一種協(xié)同的機制調(diào)控和保護(hù)著內(nèi)含子的剪接。為了證實這一假設(shè)，我們利用帶有內(nèi)含子的慢病毒載體質(zhì)粒制備了假病毒，并以此制備了病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠。我們發(fā)現(xiàn)，在這假病毒和轉(zhuǎn)基因小鼠中均有內(nèi)含子存在的現(xiàn)象。

2、這激勵我們嘗試在CMV啟動子與帶有內(nèi)含子DNA間插入一段病毒功能性片段構(gòu)建了一系列載體，然后在添加與不加Rev質(zhì)粒的情況下轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。通過提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR的方法獲得含有內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄本與全部轉(zhuǎn)錄本的比值（I/E），并以此衡量病毒片段對內(nèi)含子的保護(hù)能力。我們的結(jié)果表明Leader(包含了剪接功能域1和包裝信號的片段)在與Rev共作用時，其I/E的比值達(dá)到90％左右。而刪除了Leader的病毒質(zhì)粒，則失去了保