以脈絡(luò)學(xué)說為指導(dǎo)探討內(nèi)皮細(xì)胞損傷對AS發(fā)病影響及通心絡(luò)干預(yù)作用研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis AS)是心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙則是AS的始動(dòng)因素并貫穿全過程;血小板作為血液成分之一，通過活化后釋放諸多生物活性物質(zhì)或膜糖蛋白，介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，參與到AS免疫、炎癥、血栓形成等病理階段。導(dǎo)師傳承《內(nèi)經(jīng)》“血脈”理論，系統(tǒng)構(gòu)建脈絡(luò)學(xué)說，提出“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”概念，并提出其核心理論—營衛(wèi)理論，AS及其相關(guān)心腦血管病即屬于脈絡(luò)病變范疇[1-2]。基于營氣與血管

2、內(nèi)皮相關(guān)性，血液成分與營血相關(guān)性，本研究探討血小板活化對內(nèi)皮細(xì)胞損傷致AS的影響及通絡(luò)代表性藥物通心絡(luò)膠囊的干預(yù)作用，繼而豐富發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說指導(dǎo)AS防治的科學(xué)內(nèi)涵。
　　目的:
　　以脈絡(luò)學(xué)說營衛(wèi)理論為指導(dǎo)，闡釋營血病變對脈絡(luò)—血管系統(tǒng)功能結(jié)構(gòu)影響在AS發(fā)病中的作用及通心絡(luò)干預(yù)效應(yīng)。以“營血”中血小板為研究對象，采用在體動(dòng)物和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究血小板活化CD40L/CD40對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，同時(shí)探討通絡(luò)代表藥物通心絡(luò)對血小

3、板活化誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):70只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、通心絡(luò)低、中、高劑量組、阿托伐他汀組和阿司匹林組，每組10只。除正常組外，其余各組均喂飼高脂飼料，用藥組在給予高脂飼料的同時(shí)給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取主動(dòng)脈標(biāo)本及血清進(jìn)行指標(biāo)檢測。圍繞血管內(nèi)皮相關(guān)指標(biāo):采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平;ELISA

4、法檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)含量;油紅O染色和HE染色觀察主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜病理改變。圍繞血小板結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo):采用透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu);血細(xì)胞分析儀檢測血小板參數(shù)變化;流式細(xì)胞儀觀察血小板胞內(nèi)Ca2+變化;ELISA法檢測血小板分泌血小板因子4(PF4)、可溶性CD62P(sCD62P)表達(dá)變化;ELISA法檢測0、2、4、8、12周兔血清可溶性CD40L(s

5、CD40L)表達(dá)變化;免疫組化定位檢測主動(dòng)脈CD40L、CD40表達(dá)情況;Western blot檢測主動(dòng)脈CD40L、CD40、caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測主動(dòng)脈CD40L、CD40mRNA表達(dá)變化。
　　(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，采集健康人靜脈血分離血小板，①制備靜息血小板懸液、活化血小板懸液、通心絡(luò)血小板懸液，分別與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)。采用動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察

6、血小板聚集、粘附及釋放過程，觀察血小板對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與增殖的影響，同時(shí)觀察內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位動(dòng)態(tài)變化過程;流式細(xì)胞儀檢測血小板膜CD40L、CD62P表達(dá)變化;ELISA法檢測血小板分泌sCD40L表達(dá)變化。②為探討CD40L/CD40在活化血小板損傷內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，采用CD40L單克隆抗體阻斷活化血小板上清液中CD40L與內(nèi)皮細(xì)胞CD40結(jié)合，實(shí)驗(yàn)分為正常組、ADP陰性對照組，靜息血小板組、活化血小板組、通心絡(luò)組、CD40L配體單

7、克隆抗體組，采用MTS法檢測內(nèi)皮細(xì)胞生存活性改變，熒光法檢測內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位改變。③為驗(yàn)證CD40L在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用，采用重組可溶性人CD40L(rshCD40L)建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，實(shí)驗(yàn)分為正常組、rshCD40L模型組、通心絡(luò)低、中、高劑量組，采用Western blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2相關(guān)信號通路ERK1/2、p-ERK1/2、CyclinD、C-Myc、Cytc、Bax、Bcl-2、Caspase3蛋白表

8、達(dá)變化。④為探討通心絡(luò)抑制CD40L誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默ERK1/2基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分為正常組、siRNA對照組、siRNA組、通心絡(luò)組、通心絡(luò)+siRNA組，采用Westernblot檢測內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2相關(guān)信號通路p-ERK1/2、CyclinD、C-Myc、Cytc蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):①高脂喂養(yǎng)建立兔AS模型中血管內(nèi)膜增厚，血清血脂TC、TG、LDL-C升高，炎

9、癥因子TNF-α、IL-1β、hs-CRP表達(dá)增多，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞caspase3、Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。通心絡(luò)能夠降低血脂水平，減少TNF-α、IL-1β、hs-CRP含量，抑制內(nèi)膜增生，同時(shí)降低caspase3、Bax蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)(P＜0.05,P＜0.01)。②AS模型中血小板結(jié)構(gòu)改變，分泌sCD40L、PF4、sCD62P明顯增多，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平增加。免疫組化、Western blot

10、及RT-PCR結(jié)果顯示主動(dòng)脈CD40L、CD40蛋白和基因表達(dá)增強(qiáng)。通心絡(luò)明顯改善血小板結(jié)構(gòu)，降低血小板分泌sCD40L、PF4、sCD62P水平，同時(shí)降低胞漿內(nèi)鈣離子含量，并可下調(diào)CD40L、CD40蛋白和基因表達(dá)(P＜0.05,P＜0.01)。
　　(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):①血小板活化后發(fā)生聚集、粘附和釋放反應(yīng)，CD62P、CD40L、sCD40L水平表達(dá)增高，降低內(nèi)皮細(xì)胞NO水平、升高ET-1、表達(dá)，同時(shí)降低內(nèi)皮細(xì)胞生存活性，促進(jìn)線

11、粒體膜電位下降(P＜0.05,P＜0.01)。②血小板CD40L/CD40軸通過抑制ERK1/2活性在活化血小板誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，增加Cytc、caspase3、Bax蛋白表達(dá)，降低CyclinD、Bcl-2蛋白表達(dá)(P＜0.05,P＜0.01)③通心絡(luò)抑制CD62P、CD40L、sCD40L表達(dá)，同時(shí)降低活化血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力。通心絡(luò)可能通過激活ERK1/2信號相關(guān)通路抑制活化血小板CD40L/CD40