馬兜鈴酸-I致胚胎干細胞衍生肝樣組織癌前病變評價模型建立.pdf

1、本文對馬兜鈴酸--I致胚胎干細胞衍生肝樣組織癌前病變評價模型建立進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：馬兜鈴酸-Ⅰ致胚胎干細胞衍生擬胚體分化肝樣組織過程癌前病變評價模型建立。
　　目的：利用人類致癌劑馬兜鈴酸-Ⅰ（aristolochic acidⅠ，AAⅠ）與小鼠胚胎干（embryonic stem，ES）細胞衍生擬胚體（embryoid body，EB）分化肝樣組織過程共孵育體系，構(gòu)建肝臟癌前病變體外替代研究模

2、型，評價化合物是否具有潛在致肝癌前病變作用。
　　方法：ES細胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)5天得EBs，EBs貼壁培養(yǎng)18天得成熟肝樣組織;肝樣組織分化成熟時(D5+18)，免疫熒光考察肝樣細胞及組織特異性蛋白表達;H&E染色考察肝樣組織結(jié)構(gòu)表型;qRT-PCR考察肝樣細胞功能相關(guān)基因表達水平;ELISA法考察細胞培養(yǎng)上清液中白蛋白(albumin，ALB)分泌水平;糖原合成染色、吲哚氰綠(Indocyanine Green，ICG)攝取、尿素合

3、成實驗考察肝樣細胞功能。MTT法得AAⅠ與EBs共孵育濃度;EBs貼壁培養(yǎng)當(dāng)天(D5+0)開始加入AAⅠ;D5+18時流式細胞術(shù)檢測肝樣細胞的分化率;ELISA法檢測上清液中ALB、谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)、白細胞介素-6(interleukin6，IL-6)和甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）

4、的含量;免疫熒光檢測ALB與IL-6、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子-3（signaling transducer and activator of transcription-3，STAT3）、磷酸化STAT3(p-STAT3)、原癌蛋白Myc（oncogenic transcription factor Myc，c-Myc）和癌胚RNA結(jié)合蛋白Lin28同源物B(oncofetal RNA-binding protein Lin28 homo

5、log B，Lin28B)、AFP等共表達情況;Western Blot檢測肝樣組織中c-Myc、Lin28B、AFP及IL-6/STAT3、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)、絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、激活蛋白-1(activator protein1，AP-1)等信號通路蛋白表達情況;將成熟肝樣組織注射到裸鼠背部皮下，考察肝樣組織

6、成瘤性;將腫瘤取出制備石蠟切片，H&E染色考察腫瘤的組成結(jié)構(gòu);免疫熒光考察ALB與AFP、膽管標(biāo)志物細胞角蛋白7(cytokeratin7，K7)、細胞角蛋白19(cytokeratin19，K19)的共定位情況;Western Blot、qRT-PCR法考察腫瘤組織惡性相關(guān)蛋白、基因的表達情況。
　　結(jié)果：⑴ES細胞衍生肝樣組織鑒定：形態(tài)學(xué)表征:D5+18時，光鏡下肝樣細胞呈成熟的雙核表型;免疫熒光染色肝細胞特異性蛋白ALB、肝

7、細胞核因子4α、α1-抗胰蛋白酶等呈陽性，ALB與肝血竇內(nèi)皮細胞標(biāo)志蛋白血小板內(nèi)皮細胞粘附分子PECAM-1鑲嵌成肝樣組織表型;H&E染色可見典型的肝樣組織血竇樣結(jié)構(gòu)與肝樣細胞鑲嵌排列；功能表征:qRT-PCR結(jié)果顯示肝樣細胞細胞色素P450代謝酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等基因表達水平接近肝臟細胞實際水平;肝樣細胞顯示出穩(wěn)定的ALB分泌水平、尿素合成水平、糖原合成水平及ICG攝取功能。⑵AAⅠ致ES細胞衍生EBs分化肝樣組織過程癌

8、前病變體外替代研究評價模型構(gòu)建：分化體系質(zhì)控指標(biāo):終點流式細胞術(shù)、免疫熒光及ELISA結(jié)果顯示，與DMSO相比，1.25μM及2.50μM AAⅠ不影響肝樣細胞的分化率、ALB分泌水平及肝血竇樣結(jié)構(gòu)；ELISA結(jié)果顯示，與DMSO相比，AAⅠ顯著上調(diào)肝樣組織培養(yǎng)上清液中ALT、AST、IL-6及AFP的分泌量，提示肝樣細胞膜受到損傷，肝樣組織中Kupffer樣細胞被激活，分泌大量IL-6，使肝樣組織彌漫浸潤在炎癥微環(huán)境中;AAⅠ顯著上調(diào)

9、肝樣組織c-Myc及Lin28B的表達;加入AAⅠ后，在終末分化的肝樣組織中尚有表達幼稚的肝細胞合成分泌的AFP，極少量肝樣細胞胞漿表達干性標(biāo)志物八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(Oct4)，提示AAⅠ可能使肝樣組織中部分肝樣細胞發(fā)生了脫分化；Western Blot結(jié)果顯示，AAⅠ可激活I(lǐng)L-6/STAT3通路、顯著上調(diào)MAPK家族成員細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulatedkinase1/2，ER

10、K1/2)的磷酸化水平及激活蛋白-1（activator protein1，AP-1）成員c-Jun和c-Fos的入核水平；體內(nèi)評價階段，DMSO與AAⅠ組肝樣組織細胞注射到裸鼠皮下均能成瘤;H&E染色結(jié)果顯示，DMSO組腫瘤內(nèi)細胞類型雜亂無章，呈畸胎瘤三胚層結(jié)構(gòu);AAⅠ組腫瘤內(nèi)部大多結(jié)構(gòu)較單一，偶見畸胎瘤結(jié)構(gòu)，部分腫瘤內(nèi)存在細胞呈核大深染的HCC樣特征區(qū)域;免疫熒光結(jié)果顯示，DMSO組腫瘤未見ALB分別與AFP、K7、K19共染的細胞

11、;AAⅠ組腫瘤ALB與AFP、K7、K19的共染率分別為37.50％，54.17％和50.00％，提示AAⅠ組腫瘤內(nèi)的肝樣細胞較幼稚，呈腫瘤祖/干細胞表型，這些細胞很可能是形成該組腫瘤的源細胞。
　　結(jié)論：利用AAⅠ引起ES細胞衍生EBs分化肝樣組織炎性損傷伴癌前病變表型特征，初步構(gòu)建了ES細胞衍生EBs分化成熟肝樣組織癌前病變體外預(yù)測評價體系，為研究肝臟癌前病變、預(yù)測評價化合物的潛在致肝臟癌前病變作用提供體外替代模型。
　

12、　第二部分：馬兜鈴酸-Ⅰ致分化成熟肝樣組織癌前病變評價模型建立。
　　目的：利用AAⅠ與ES細胞衍生成熟的肝樣組織共孵育體系，構(gòu)建肝臟癌前病變體外替代模型，評價化合物是否具有潛在致肝癌前病變作用。
　　方法：ES細胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)5天EBs，EBs貼壁培養(yǎng)18天得成熟肝樣組織;MTT法得AAⅠ與成熟肝樣組織共孵育濃度;肝樣組織分化成熟時(D5+18)開始持續(xù)加入AAⅠ10天（D23+0至D23+10）;D23+10時，ELISA

13、法檢測細胞培養(yǎng)上清液中ALB、IL-6含量;免疫熒光檢測ALB與p-STAT3、c-Myc、Lin28B、AFP、NF-κB(p65)及NF-κB(p50)共定位情況。
　　結(jié)果：1.25，2.50，5.00，10.00μMAAⅠ與成熟肝樣組織共孵育10天，ELISA和免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，1.25，2.50μM AAⅠ不影響肝樣細胞表達并分泌ALB水平，5.00，10.00μM AAⅠ分別從加入第8天和第6天起顯著下調(diào)

14、ALB分泌水平;其中與10.00μM AAⅠ共孵育還伴有少量肝樣細胞凋亡發(fā)生;1.25，2.50，5.00，10.00μM AAⅠ均能顯著上調(diào)IL-6分泌水平;與10.00μM AAⅠ共孵育時，IL-6分泌呈先升后降的趨勢;綜合考慮選擇5.00μM AAⅠ進行后續(xù)實驗;免疫熒光結(jié)果顯示，與5.00μM AAⅠ共孵育10天，肝樣組織中出現(xiàn)少量c-Myc，Lin28B，AFP與ALB共表達的肝樣細胞，同時NF-κB(p65)也有少量入核激活

15、，提示AAⅠ與分化成熟的肝樣組織共孵育也可引發(fā)癌前病變。
　　結(jié)論：構(gòu)建了分化成熟的肝樣組織與AAⅠ共孵育癌前病變體外預(yù)測評價體系，為研究肝臟癌前病變、預(yù)測評價化合物的潛在致肝臟癌前病變作用提供體外替代模型。
　　第三部分：積雪草酸、五味子乙素對馬兜鈴酸-Ⅰ致胚胎干細胞衍生EBs分化肝樣組織炎癥及癌前病變對抗活性相關(guān)研究。
　　目的：探索積雪草酸(Asiatic acid，AA)和五味子乙素（Schisandrin B

16、，Sch B）是否具有對抗AAⅠ致ES細胞衍生EBs分化肝樣組織炎癥損傷和癌前病變的活性，論證該體外替代模型的適用性。
　　方法：MTT法得AA和Sch B分別與AAⅠ共孵育ES細胞及EBs分化肝樣組織過程共孵育的濃度;EBs貼壁培養(yǎng)當(dāng)天開始加入2.5μM AAⅠ和適合濃度的AA或Sch B，肝樣組織分化成熟時，流式細胞術(shù)檢測肝樣細胞分化率;ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中ALB、ALT、IL-6和AFP含量;免疫熒光檢測ALB與IL

17、-6、c-Myc和Lin28B等蛋白共定位情況;Western Blot法檢測肝樣組織中炎癥、癌前病變相關(guān)蛋白的表達;分別將與DMSO、AAⅠ、AAⅠ+AA共孵育的肝樣組織注射到裸鼠皮下，考察AA對AAⅠ致衍生肝樣組織成瘤性的影響;將腫瘤取出制備石蠟切片，H&E染色考察各組腫瘤的組成結(jié)構(gòu)，免疫熒光雙染法考察癌前病變相關(guān)蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：⑴ELISA結(jié)果顯示，單加AAⅠ組上清液ALT、IL-6和AFP較DMSO組均顯著上調(diào)

18、;1.00μM AA及5.0、10.0μM Sch B與AAⅠ共孵育，上清液ALT和IL-6含量顯著下調(diào);僅1.00μM AA與AAⅠ共孵育，AFP的含量與單加AAⅠ組相比顯著下調(diào)，而Sch B不能下調(diào)上清液中AFP的含量。⑵Western Blot及免疫熒光結(jié)果顯示，1.00μM AA顯著下調(diào)AAⅠ致c-Myc、Lin28B、AFP的表達上調(diào)，Sch B不能下調(diào)AAⅠ引起的c-Myc、Lin28B和AFP的表達上調(diào);AA、Sch B可

19、顯著下調(diào)AAⅠ致衍生肝樣組織IL-6/STAT3、p-ERK1/2 MAPK及c-Fos AP-1的表達上調(diào)，且10.0μM Sch B可顯著上調(diào)Nrf2的表達。⑶體內(nèi)評價階段H&E染色顯示，AAⅠ+AA組呈細胞核大深染、有絲分裂相多、排列紊亂、假小葉或微血管浸潤等HCC樣表型的腫瘤數(shù)量(10/23)與AAⅠ組(11/23)沒有顯著性差異;免疫熒光結(jié)果顯示，與DMSO組相比，AAⅠ組腫瘤ALB與AFP、K7、K19共染的細胞顯著增多，共